基于蛋白质组学的前列腺癌间质标记物筛选及MYL9表达的临床研究

发布时间：2020-07-26 09:17

【摘要】：研究背景及目的：前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内已经成为男性第二大类常见肿瘤,位于癌症相关死亡率第六位,严重危害中老年男性健康。前列腺癌的发病率及死亡率存在很大的地域差异,在美国已成为发病率及死亡率第一位的恶性肿瘤,在亚洲国家前列腺癌的发病率仍处于较低水平。随着社会人口的老龄化及诊断筛查技术的进步,我国前列腺癌发病率在逐年提高,已位于男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第三位,仅次于膀胱癌和肾癌。目前,对前列腺癌的筛查诊断主要依靠血清PSA检测及前列腺穿刺病理活检,但因PSA具有诊断敏感性及特异性不高,不能判别进展性和惰性前列腺癌等缺点,从而导致不必要的前列腺穿刺活检及前列腺癌的过度治疗。因此,研究更有效的前列腺癌标记物对提高前列腺癌的早期诊断及为患者制定合理的个体化治疗方案,减少前列腺癌患者死亡率和改善生活质量有重要的意义。前列腺癌的病因及发病机制尚未完全清楚。既往人们对前列腺癌发病机制的研究大部分集中于前列腺癌细胞,认为前列腺癌的发生主要是前列腺上皮细胞基因突变的结果,上皮细胞癌基因激活和抑癌基因失活是前列腺癌发生、发展的基础。目前认为前列腺癌的形成是遗传、炎症、环境等多因素综合作用的结果,涉及一系列复杂的生物学过程,包括正常上皮细胞向肿瘤细胞转变、上皮-间质细胞的相互作用、肿瘤的生长及局部侵犯、远处转移等。研究已证实肿瘤间质微环境的改变是肿瘤发生发展的一个共同特征,肿瘤-间质的相互作用在肿瘤的进展中扮演着重要的作用,肿瘤间质成分的改变可以破坏正常前列腺微环境的内稳态并影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移能力。上皮间质转化能够导致肿瘤细胞的凋亡能力减弱、化疗耐药能力增强,成为晚期肿瘤治疗失败的重要原因。深入研究前列腺癌间质在前列腺癌发病机制及疾病转归的作用,将对前列腺癌的防治产生深远的影响。蛋白质组学是上世纪90年代发展起来的研究生物体蛋白质的一门新兴学科,是继基因组学和转录组学之后的又一个细胞生物学高通量研究方法。能大规模研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、不同蛋白质间的相互作用等。由于蛋白质是基因功能的直接执行者,蛋白质组学研究可揭示生物体蛋白质改变与机体疾病发生的关系,为阐明疾病的发病机制提供直接的依据。蛋白质组学因其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,已成为研究肿瘤标记物和药物靶标最有效的方法之一,在肿瘤的临床诊断和治疗方面有十分诱人的前景。本研究通过激光捕获显微切割结合蛋白组学技术检测前列腺癌与癌旁良性组织的差异表达蛋白,并利用生物信息学工具对差异表达蛋白进行聚类分析,筛选其中在前列腺癌间质表达的基因。选取差异表达最明显的间质表达基因MYL9,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术进一步验证其在前列腺癌及非癌组织的差异表达,再通过大样本组织芯片免疫组化检测MYL9在前列腺癌的表达模式,验证基于蛋白组学结果筛选前列腺癌间质标记物的可靠性。结合前列腺组织芯片样本相关临床病理数据和Taylor数据库,统计分析前列腺癌间质MYL9表达与前列腺癌临床病理分期、血清PSA水平、无生化复发生存率和总体生存率等临床病理特征的关系,研究前列腺癌间质MYL9表达在前列腺癌进展和预后评估中的作用。本研究希望能发现前列腺癌间质特异性标记物,为前列腺癌上皮-间质相互作用机制的研究提供一定的依据,并为前列腺患者的治疗提供潜在的间质靶标。研究材料：1：用于蛋白质组学检测的4例前列腺癌及配对癌旁前列腺组织来源于广州市第一人民医院2012年5月至2012年8月行根治性前列腺切除并双侧盆腔淋巴结清扫术的前列腺癌病人,患者年龄介乎于54至70岁,均属于T2NOMO分期。用于Western Blot检测的20例前列腺癌及配对癌旁前列腺冰冻组织取自广州市第一人民医院2008至2013年行前列腺癌根治术的前列腺标本,患者年龄介乎于56-68岁(平均61.31±5.65岁)。用于RT-qPCR的40对前列腺癌及良性癌旁石蜡组织受赠于美国哈佛大学麻省总医院病理实验室组织库,这些标本是2012年行前列腺癌根治术或经尿道前列腺电切术(TURP)的前列腺组织,患者年龄介乎于58-83岁(平均67.10±6.95),其中高分化前列腺癌12例,中分化15例,低分化13例。2：含有99例前列腺癌和81例良性前列腺组织样本的组织芯片购买于上海芯超生物科技有限公司(Cat No:HPro-Ade180PG-01)。前列腺癌患者平均年龄70.71±7.99岁,其中血清PSA≥4nmol/ml的有87例、Gleason≥8的有28例。3. Taylor数据库包含149例原发性前列腺癌及29例良性癌旁组织样本的mRNAs水平及详细临床病理资料。本研究由广州市第一人民医院伦理委员会批准,所用组织样本的处理均符合伦理及法律法规。所有标本获取的前列腺癌患者术前均未接受放射治疗、化疗或内分泌治疗。研究方法：1：收集4例新鲜前列腺癌及其配对癌旁样本并冰冻保存,通过激光捕获显微切割技术获取较纯的前列腺癌和癌旁组织。提取并纯化前列腺癌及癌旁组织的蛋白质,经双向凝胶电泳→凝胶扫描成像分析以获得各蛋白质含量的数据,并对所得数据进行配对t检验,发现差异表达明显的蛋白质(差异表达倍数高于2)。再通过凝胶染色→差异蛋白质点切割→胶内酶解→质谱分析明确差异表达蛋白质的种类。2：利用人类蛋白质图集数据库http://www.proteinatlas.org (HPA)、 http://www.pantherdb.org数据库及http://www.string-db.org数据库,对蛋白质组学发现的差异表达蛋白进行聚类分析及蛋白质相互作用分析,筛选出前列腺癌间质基因。3：选取前列腺癌差异表达最明显的间质基因,通过RT-qQPCR检测其在40对前列腺癌及癌旁组织的mRNA表达,Western Blot检测其在20对前列腺癌及癌旁组织的蛋白质表达,进一步验证该基因在前列腺癌及癌旁组织的差异表达情况。4：对大样本前列腺组织芯片进行免疫组化染色评分,检测所选取的间质基因在前列腺癌的表达模式,并分析其表达水平与前列腺癌PSA、Gleason评分、临床病理分期和疾病转移的关系。5：利用Taylor数据库分析间质基因表达水平与前列腺癌生化复发和总体生存率的关系,并分析该基因与上皮间质转化标记蛋白E-cadherin、Vimentin的相关性,研究其在前列腺癌发生发展中的作用及可能机制。统计学处理：全部资料均采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。正态分布计量资料用均数±标准差表示,两组配对计量资料的均数比较采用配对t检验,非配对计量资料采用独立样本t检验。前列腺癌不同间质比例组间基因免疫组化评分比较采用Kruskal-Wallis检验,并进行Spearman相关分析。候选间质基因与E-cadherin等其他前列腺癌上皮间质指标的表达量关系用Pearson相关分析。生存分析第一终点事件是生化复发,第二终点事件是患者死亡。Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验研究间质基因表达水平对前列腺癌生化复发和总体生存率的影响。用单因素及多因素COX回归比例风险模型分析前列腺癌间质基因表达与生化复发及死亡的风险比,研究间质基因能否作为前列腺癌生化复发和死亡的独立预测因素。统计结果P值小于0.05认为有统计学意义。结果：1：蛋白质组学检测4对前列腺癌和对应癌旁组织的蛋白质差异表达情况。双向凝胶电泳及凝胶扫描成像分析,发现在前列腺癌组织中差异表达倍数大于2的蛋白质点共有155个,其中66个蛋白点明显下调,89个蛋白点明显上调。通过凝胶染色,切取差异蛋白点进行胶内酶解及质谱分析,共鉴定出66个蛋白质,其中40个呈上调表达,26个呈下调表达,其中MMC2上调表达最明显(Average Ratio:4.29; P=0.023), MYL9下调表达最明显(Average Ratio:-5.67; P=0.008)。2：通过HPA数据库对蛋白组学所鉴定的66个前列腺癌差异表达蛋白在前列腺癌组织中的表达模式进行检索分析,发现主要在前列腺癌间质中表达而癌细胞阴性或弱阳性表达的间质基因14个,其中MYL9、LPP、CKB、GSTM2、GSTP1、 DPYSL3、ACTC1、GSTM3、PRPH呈下调表达,FGB、ACY1、VCL、HSPB1、MSN呈上调表达。3：进一步通过http://www.pantherdb.org数据库和http://www.string-db.org数据库进行基因功能分析及基因关联分析,发现14个间质基因参与细胞粘附结合、细胞免疫、细胞代谢等功能,并涉及VEGF、Wnt等信号通路的调控,间质基因相互关联不明显。我们选取在前列腺癌中差异下调表达最明显的MYL9进一步研究其在前列腺癌表达的临床意义。4:RT-qPCR检测MYL9在40对前列腺癌及对应的癌旁良性组织石蜡样本中的mRNA差异表达情况。发现MYL9在前列腺癌组织中的相对表达量为1.30±0.63,显著低于对应的癌旁组织中的相对表达量为1.91±0.70(P0.001),提示MYL9在前列腺癌中的表达明显下调,与蛋白组学发现结果相符。5:Western Blot检测MYL9在20对前列腺癌与癌旁组织中的蛋白质差异表达。结果显示MYL9表达量在前列腺癌组织中显著低于癌旁组织(前列腺癌=0.23±0.08,癌旁=0.73±0.06,P0.001)。6：大样本前列腺组织芯片免疫组化结果显示MYL9在前列腺癌及良性前列腺组织中均主要表达于间质细胞的细胞质,在正常前列腺上皮细胞及前列腺癌细胞呈阴性表达。MYL9在前列腺癌组织中的表达明显低于良性癌旁组织(IRS: PCa=3.36±1.58 vs. Benign=4.85±1.02, P0.001)。MYL9的表达水平与前列腺癌的临床分期呈显著负相关(r=-0.550,P0.001)。7:Kaplan-Meier生存分析显示MYL9表达量与前列腺癌无生化复发生存率及总体生存率表现为显著相关性(P值分别为0.001和0.012),前列腺癌间质中MYL9表达水平越高,则患者无生化复发生存率及总体生存率越高。Cox比例风险回归模型提示MYL9是一个能预测前列腺癌患者生化复发(HR=0.53,95%CI: 0.30～0.74)和死亡(HR=0.06,95%CI:0.01～0.45)的独立影响因素。8：MYL9与上皮间质转化及间质标记性蛋白E-cadherin、Vimentin、TGF-β1和α-SMA的Pearson相关性分析,发现MYL9表达与E-cadherin呈显著相关(r=0.949,P0.001),与α-SMA、TGF-β1及Vimentin也有相关性(r=0.301, P=0.014; r=0.360, P0.001; r=0.336, P0.001)。提示前列腺癌间质中MYL9表达可能与前列腺癌细胞上皮间质转化及间质重构有关。结论：1、蛋白质组学发现前列腺癌差异表达蛋白质,结合生物信息学分析可以有效筛选前列腺癌间质生物标记物,为研究前列腺癌间质成分在前列腺癌进展中的作用机制提供线索。2、MYL9在前列腺癌间质中的表达显著低于良性癌旁组织,其下调表达参与前列腺癌的形成及进展。3、前列腺癌组织MYL9表达与患者的不良预后显著相关,根据MYL9表达水平可判断前列腺癌的恶性程度。4、MYL9可以作为预测前列腺癌患者总体生存率和无生化复发生存率的一个独立指标,并是前列腺癌治疗的一个潜在间质靶标。5、前列腺癌间质MYL9下调表达可能通过诱导肿瘤细胞上皮-间质转化及前列腺癌间质重构,促进前列腺癌的进展。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【图文】：

间质成分包括成纤维细胞（加ｒｏｂｌａｓｔ）、胶原细胞、平滑肌细胞、挪巴逡逑免疫细胞、神经内分泌细胞、血管、淋己管、神经突触、细胞外基质和存在于逡逑细胞外基质中的多种生长因子及调节因子、基质重构酶等口］，（图２）。逡逑Ｅ？一邋？邋ＵｆＴｉｍａ逡逑ｙ逦Ｂｌｏｏｄ邋ＶｅｓＭｔ逡逑－酒Ｖ－逡逑

本文编号：2770574