【摘要】：背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管病变之一,病程早期出现肾小球高滤过,而后出现微量白蛋白尿、大量蛋白尿及进行性肾功能减退,最终发展成为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)。近年来细胞和分子水平的研究提出了许多糖尿病肾病的病理机制,主要包括血流动力学改变、炎症反应、氧化应激、蛋白激酶C活化、糖基化终末产物生成增多、维生素D受体表达减少、足细胞损伤、内皮细胞损伤等。肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cells,GEnCs)构成肾小球滤过膜的内层,维持肾小球滤过膜的完整性,对于阻止尿蛋白漏出、维持正常肾功能均具有重要的意义。高血糖可引起GEnCs损伤,表现为内皮通透性增加、舒缩功能障碍及黏附因子表达上调等,导致蛋白尿和肾功能受损。据报道,高糖诱导下GEnCs可发生表型转变,表现为内皮细胞表型缺失同时出现间充质细胞表型,此转换被称为内皮细胞间充质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)。近年来,有学者认为糖尿病肾病可能由高血糖激活固有免疫应答引起。高糖诱导下,固有免疫细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)家族中的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)被激活,引起固有免疫应答,导致糖尿病肾病的进展。目前关于NOD2在内皮细胞损伤中的作用尚未见报道,探讨NOD2是否参与高糖诱导的GEnCs EndMT对DN发病机制的理解及临床治疗具有重要意义。目的在此研究中,我们培养小鼠GEnCs的条件永生化细胞系,用高糖加以刺激,模拟人体内高血糖环境,观察高糖诱导下GEnCs中NOD2及EndMT相关指标的表达水平;用NOD2激活剂MDP激活NOD2及用shRNA沉默NOD2表达以明确NOD2对高糖诱导的EndMT的影响;用U0126抑制MEK1/2表达观察EndMT相关信号通路分子的变化,验证MEK/ERK信号通路是否介导GEnCs EndMT。总体而言,我们研究NOD2是否通过MEK/ERK信号通路介导高糖诱导的GEnCs EndMT。方法1探究高糖诱导下GEnCs中NOD2及End MT相关指标的表达变化1.1观察不同浓度葡萄糖刺激下GEnCs中NOD2的表达水平。体外培养小鼠GEnCs并分成四组:正常对照组(葡萄糖5.6mmol/L)、20mmol/L葡萄糖组、40mmol/L葡萄糖组、渗透压对照组(5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇),不同培养基作用24h后进行检测。Western Blot检测NOD2的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NOD2的mRNA表达水平,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测NOD2蛋白在GEn Cs中的定位及分布。1.2观察高糖不同刺激时间下GEnCs中EndMT相关指标(内皮细胞标志物CD31、间充质细胞标志物α-SMA)的表达水平。对小鼠GEnCs加以不同时间的高糖(葡萄糖40mmol/L)刺激,分别为12h、24h。Western Blot检测高糖刺激下CD31和α-SMA的蛋白表达水平。2探究NOD2在高糖诱导的GEnCs EndMT中的作用2.1观察MDP刺激下CD31、α-SMA的表达水平。对小鼠GEnCs加以不同时间的MDP(浓度为2ug/mL)刺激,分别为12h、24h。Western Blot检测MDP刺激下CD31和α-SMA的蛋白表达水平。2.2验证NOD2特异性shRNA对GEnCs的转染效率。将shRNA转染至GEnCs,体外培养小鼠GEnCs并分成三组:正常对照组、乱序对照(scramble)组、shRNA干扰组。Western Blot检测NOD2的蛋白表达水平。2.3观察shRNA沉默NOD2表达后GEnCs中CD31、α-SMA的蛋白表达水平。将shRNA转染至GEnCs,共分为四组:正常对照组、高糖组、高糖+scramble组、高糖+shRNA干扰组。Western Blot检测CD31和α-SMA的蛋白表达水平。3探究NOD2是否通过MEK/ERK信号传导途径介导高糖诱导下GEnCs EndMT3.1观察高糖刺激下GEnCs中MEK/ERK信号通路活性,Western Blot检测高糖诱导下MEK1/2、磷酸化MEK1/2(p-MEK1/2)的蛋白表达水平。相对应,对GEnCs加入MEK1/2抑制剂U0126刺激1h,后加入高糖培养24h,分组为:正常对照组、高糖组、高糖+抑制剂U0126组。Western Blot检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表达水平。3.2观察高糖刺激下,用shRNA沉默NOD2表达后,GEnCs中MEK/ERK信号通路相关分子的表达水平。分组为:scramble组、shRNA干扰组。Western Blot检测MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达水平。3.3观察高糖刺激下加入MEK1/2抑制剂U0126后,GEnCs中CD31、α-SMA的表达水平。分组为:正常对照组、高糖组、高糖+抑制剂U0126组。Western Blot检测CD31、α-SMA蛋白表达水平。IF检测CD31、α-SMA的细胞定位和蛋白表达分布。结果1.高糖刺激下,GEnCs中NOD2的蛋白及mRNA表达均升高。用高糖和NOD2激活剂MDP刺激GEnCs,均检测到内皮细胞标记物CD31表达下降和间充质细胞标记物α-SMA表达升高,且差异具有统计学意义(P0.05),提示高糖可能通过激活NOD2以诱导GEnCs间充质转分化。2.转染shRNA至GEnCs后,NOD2表达下降,提示NOD2特异性shRNA可有效沉默NOD2表达,且shRNA可逆转高糖诱导的CD31表达下降和α-SMA表达升高,且差异具有统计学意义(P0.05),验证NOD2可介导高糖诱导的GEnCs间充质转分化。3.高糖刺激下,磷酸化MEK1/2(p-MEK1/2)及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达增加;用U0126抑制MEK1/2,可降低p-ERK1/2表达;这些结果显示高糖诱导下,MEK/ERK途径被激活。将shRNA转染到GEnCs中,结果显示沉默NOD2表达后p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达显著降低,提示NOD2参与MEK/ERK信号通路的激活。应用MEK1/2抑制剂U0126处理后,CD31表达升高、α-SMA表达下降,且差异具有统计学意义(P0.05),提示U0126可逆转NOD2引起的EndMT。这些结果提示NOD2通过MEK/ERK信号通路介导高糖诱导下肾小球内皮细胞间充质转分化。结论1.高糖诱导下,小鼠肾小球内皮细胞中NOD2表达增加,CD31表达下降α-SMA表达升高。2.沉默NOD2可逆转高糖诱导的CD31的下调和α-SMA的上调。3.NOD2通过MEK/ERK信号通路介导高糖诱导下肾小球内皮细胞间充质转分化。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：
实验结果 GEnCs 中 NOD2 的表达肾小球内皮细胞 GEnCs，并以不同浓度梯度或，蛋白质印迹法（Western Blot）结果显示：随延长，NOD2 的蛋白表达逐渐升高（P<0.05）。
19浓度及不同刺激时间下 GEnCs 中 NOD2 的 mRN糖刺激下 GEnCs 中 NOD2 的 mRNA 表达 B：高糖间下 GEnCs 中 NOD2 的 mRNA 表达。*与对照相小球内皮细胞 GEnCs，并以高糖进行刺激 主要分布于细胞胞浆中，且 NOD2 的蛋白表
20图 3 高糖刺激下 GEnCs 中 NOD2 的定位及表达注：HG:高糖（40 mmol/L 葡萄糖）；Nucleus：细胞核；Merge：融合。糖和 MDP 刺激下 GEnCs EndMT 相关指标的表达2.1 体外培养肾小球内皮细胞 GEnCs，并以不同时间梯度的高糖进行ern Blot 结果显示：随着刺激时间的延长，CD31 的蛋白质表达逐渐下A 的蛋白表达量逐渐升高（P<0.05）。见图 4A、B、C。
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