p53-CypD在缺血再灌注介导的急性肾损伤中的机制研究

发布时间：2020-08-02 06:41

【摘要】：急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是临床常见致死性的综合征,但是AKI的发生发展机制复杂,目前缺乏有效干预手段。肾脏缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)是常见的AKI病因。IRI可引起肾小管上皮细胞发生损伤,甚至死亡,导致肾功能急剧下降。既往研究表明,亲环素D(Cyclophilin D,CypD)开放细胞线粒体膜通透性转变孔(mitochondrial membrane permeability transition pore,MPTP)可引起细胞损伤进而介导肾脏IRI;但是其中引起CypD开放MPTP的机制尚未阐明。同期研究也发现在心肌、神经元等细胞中p53可与CypD相互结合从而开放MPTP。目的:本研究通过体内实验,观察大鼠肾脏IRI中p53及CypD的变化对肾小管上皮细胞损伤的作用;进一步运用体外细胞模型,探讨p53-CypD在肾脏IRI中的作用机制。方法:1.体内实验:SD大鼠双侧肾脏缺血35分钟,再灌注24小时建立IRI动物模型,检测血清肌酐及尿素氮水平、PAS染色观察肾脏病理改变、Western blot及TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡、透射电镜观察肾小管上皮细胞线粒体形态学改变、Western blot及免疫荧光染色观察肾小管中CypD及p53的改变。2.体外实验:在体外ATP耗竭细胞模型中,使用环孢素A(CsA)抑制亲环素D功能或siRNA下调p53的表达;通过Western blot及Annexin V-FITC/PI染色检测不同处理下细胞的凋亡情况、JC-1染色检测不同处理下细胞线粒体膜电位转换(mitochondrial permeability transition,MPT)、免疫荧光染色及免疫共沉淀观察CypD与p53的相互作用。结果:1.体内实验:a)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠血清肌酐及尿素氮显著升高,其肾小管上皮细胞出现空泡变性、脱落、肿胀,并主要在皮质及外髓外部出现广泛管型及小管堵塞;b)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠肾脏cleaved-caspase3的蛋白表达显著上调、肾小管上皮细胞凋亡率(TUNEL染色阳性比例)显著增加;c)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠肾小管上皮细胞线粒体出现明显的肿胀或变形、双层膜结构丧失、线粒体嵴断裂或消失;d)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠肾脏CypD表达无明显改变,p53显著上调并与CypD共定位。2.体外实验:a)与对照组比较,ATP耗竭的HK-2细胞凋亡率(Annexin V阳性细胞比例)增加、cleaved-caspase3的蛋白表达显著上调、发生MPT的细胞比例增加、p53表达增加,但是CypD表达无改变;b)与ATP耗竭组及溶剂对照组比较,CsA预处理的HK-2细胞经受ATP耗竭时,细胞凋亡率减少、cleaved-caspase3的表达水平显著下调、发生MPT的细胞比例减少、p53及CypD表达均无改变;c)与ATP耗竭组及siRNA对照组比较,si-p53预处理的HK-2细胞经受ATP耗竭时,细胞凋亡率减少、cleaved-caspase3的表达水平显著下调、发生MPT的细胞比例减少、CypD表达无改变;d)与对照组比较,ATP耗竭促进HK-2细胞p53与CypD形成复合物。结论:在肾脏IRI中,p53及CypD能够调控肾小管上皮细胞线粒体通透性转换及凋亡,且这种调控可能是通过形成复合物实现的。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

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华南理工大学硕士学位论文18图3-1 缺血再灌注导致大鼠肾功能受损。(A: 各组大鼠Scr水平；*与对照组比较P <0.05。(B: 各组大鼠 BUN 水平；*与假手术组比较 P <0.05。(C: 各组大鼠肾脏 PAS 染色；标尺=100μm；黑色箭头指示肾小管损伤。(D: 各组大鼠肾小管损伤评分; *P 与假手术组比较 P <0.05。con：对照组；sham：假手术组；IRI：缺血再灌注组；Scr：血肌酐；BUN：血尿素氮。Figure. 3-1 ischemia-reperfusion induces rats renal function damage.

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3-2缺血再灌注诱导大鼠肾小管上皮细胞发生凋亡。(A 各组大鼠肾脏cleaved-casp达水平的 Western blot 结果。(B 各组大鼠肾脏 cleaved-caspase3 表达水平 Western果的灰度分析；*与假手术组比较 P <0.05。(C 各组大鼠肾脏 TUNEL 染色阳性细例；*与假手术组比较 P <0.05。(D 各组大鼠肾脏 TUNEL 染色图。con：对照组；sh手术组；IRI：缺血再灌注组；C- caspase3：cleaved-caspase3。ure3-2 Apoptosis was induced in renal proximal tubular epithelial cell of rats with IRI.小结本研究选取 7-9 周龄的雄性 SD 大鼠（200-250g），建立了双侧肾脏缺血 35 分钟灌注 24 小时的肾脏损伤模型。结果提示：大鼠肾脏缺血再灌注模型可以导致大鼠急性肾损伤，并诱导大鼠肾小管上皮细胞出现明显的细胞凋亡。大鼠血清生化指结果提示，与正常对照组及假手术组相比，肾脏缺血再灌注的大鼠血清中肌酐及在 24 小时内发生了显著增高，提示大鼠发生急性肾损伤；肾脏组织 PAS 染色图可

线粒体形态,上皮细胞,肾小管上皮细胞,再灌注

2.11 统计学方法所有实验过程均重复至少三次，结果用算数平均数±校准差（mean±SEM）表示。数据资料利用 SPSS version 22.0 统计软件包(IBM Co., USA)进行统计学分析。两组样本间比较运用 Student’s t 检验。多组样本间比较运用单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异法(Least—SignificantDifference, LSD)。双尾检验，p 值小于 0.05 认为统计学有显著性差异。3.结果3.1 肾脏缺血再灌注对肾小管上皮细胞线粒体形态的影响利用透射电镜观察大鼠肾小管上皮细胞内的显微结构，可以发现，正常组和假手术组大鼠肾脏小管上皮细胞线粒体双层膜结构完整、线粒体嵴清晰可见，而在肾脏缺血再灌注大鼠的肾小管上皮细胞中，线粒体肿胀或变形、双层膜结构丧失、线粒体嵴断裂或消失，提示肾脏缺血再灌注会导致肾小管上皮细胞发生线粒体损伤。

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