NLRC5在急性肾损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-15 20:16

【摘要】：急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是以快速肾功能恶化为特征的一种严重的临床综合征,具有非常高的发病率和死亡率,已经成为了世界性的公共卫生问题。肾脏缺血再灌注损伤,肾毒性药物的使用以及感染导致的脓毒症是导致AKI的重要因素。尽管诱发AKI机制非常复杂,但是越来越多的文献研究表明炎症反应在AKI的病理进程中发挥重要的作用。固有免疫是机体在发育过程中形成的天然免疫防御功能,是机体对抗多种抗原物质的排斥反应。适应性免疫则是在后天病原体感染中使机体获得的抵抗感染的能力。研究发现,固有免疫和适应性免疫都参与到了 AKI相关的炎性反应中,即肾脏固有免疫系统的过度激活,导致适应性免疫功能紊乱并引发肾脏炎症反应。在AKI中,除肾脏局部浸润的炎性细胞外,肾脏固有细胞也可通过自分泌或旁分泌的方式产生更多的炎性介质和细胞因子等,进而促进炎症病变的持续进展,最终加重肾脏功能损伤。模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是固有免疫系统发挥免疫调控功能,引发炎症反应并驱动和调控适应性免疫应答的重要分子。PRRs通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)及受损组织、细胞释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP),激活下游信号通路转导,产生炎性细胞因子或Ⅰ型干扰素,进而促进炎症并驱动和调节适应性免疫应答。NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)是细胞内PRRs中的一个重要家族,目前已发现23个成员,根据效应结构域的不同分为四个亚家族。NLRC5(NLR family,CARD domain containing 5,也称为 NOD4 或 NOD27)是 NOD 受体家族中分子量最大的成员。研究表明NLRC5广泛表达于各种器官和组织中,尤其高表达于免疫组织和免疫器官中,如脾脏、淋巴结、骨髓和胸腺等。此外,NLRC5也较高的表达于肺和肠这种接触病原微生物较多的器官中。NLRC5具有多种生物学功能,并广泛参与多种疾病进程,如肿瘤、心肌纤维化、病毒感染等。NLRC5是MHCⅠ基因表达的主要调控子,可以通过调控MHCⅠ的转录来调控其表达。近年来,NLRC5的在炎性反应中的作用受到广泛关注。研究发现,NLRC5可能通过影响TLR调控NF-κB的激活和Ⅰ型干扰素信号通路和炎性体的激活来调控固有免疫应答。但也有研究表明,NLRC5可以通过结合NLRP3和ASC共同形成炎性体,从而促进caspase1,IL-1β和IL-18的表达,增强机体的炎性反应。特别是NLRC5在肾脏中的表达和病理生理条件下的作用尚不清楚。因此,深入研究NLRC5在急性肾损伤中的表达变化和作用机制具有十分重要的意义。研究目的:1.明确NLRC5在急性肾损伤中的表达变化和发生发展中的作用,并阐明是否在不同诱因引起的急性肾损伤中发挥相同的作用。2.深入研究NLRC5在急性肾损伤中的作用机制,进一步明确肾脏实质细胞或骨髓造血细胞NLRC5缺失对急性肾损伤的影响和分子作用机制。研究方法第一部分 NLRC5在肾缺血再灌注损伤中的表达变化及作用1.1 NLRC5在急性肾缺血再灌注损伤中的表达变化1.1.1小鼠组织器官和肾脏细胞系中NLRC5表达的检测RT-PCR检测野生型(WT)小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃和小肠组织中NLRC5的mRNA含量。RT-PCR分别检测小鼠足细胞(MPC)、大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)、大鼠肾小球系膜细胞(RMC)和大鼠肾小球内皮细胞(GENC)中NLRC5 的 mRNA 含量。1.1.2小鼠肾缺血再灌注模型的构建及NLRC5表达的检测选取12周龄的WT雄性小鼠(C57BL/6)和NLRC5缺失型雄性小鼠(Nlrc5-/-)。麻醉小鼠后,用线绳固定小鼠四肢,使用碘伏消毒腹部皮肤后沿中线剖开腹腔,使用动脉夹夹住双侧肾蒂,缺血30min后松开动脉夹,观察3min后待肾脏血流恢复并开始计时,分别于24h和48h处死小鼠并灌流取材。使用实时定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)和免疫组化染色(immunohistochemical staining,IHC)检测NLRC5在缺血再灌注肾脏组织中的表达。1.1.3 NLRC5与不同部位肾小管标记物的共定位通过免疫荧光(immunofluoresce,IF)双标NLRC5和不同部位肾小管标记物检测NLRC5在肾脏不同部位的表达。1.1.4 NLRC5与免疫细胞标记物的共定位通过IF方法分别对NLRC5和各免疫细胞标志物进行荧光标记。1.1.5 体外模型的建立及NLRC5的检测体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),使用三种不同处理方法模拟体内缺氧环境,分别是细胞在无血清培养基和低氧培养箱中培养90min后转为正常培养;细胞在含有抗霉素A/2-脱氧葡萄糖的无血清培养基中培养60min后换液转为正常培养;细胞在含有不同浓度氯化钴(CoCl2)的培养基中培养12h。WB检测三种处理条件下NLRC5在NRK-52E细胞中的蛋白表达水平。1.1.6 NLRC5在急性肾小管坏死病人肾脏中的表达使用免疫组化染色法检测肾癌病人癌旁组织和急性肾小管坏死病人肾活检切片标本中NLRC5的表达。1.2 NLRC5在小鼠肾缺血再灌注损伤中的功能1.2.1 WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏损伤指标的检测采用全自动生化分析仪检测WT与Nlrc5-/-小鼠血清中尿素氮的含量。采用高效液相色谱仪(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测 WT 与 Nlrc5-/-小鼠血清中肌酐的含量。1.2.2 WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏形态学损伤的检测采用苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏形态学损伤情况,并进行评分。采用组织IF方法检测肾脏损伤分子-1(Kidney injurymolecule 1,KIM-1)在WT与Nlrc5--小鼠肾脏中的表达情况,并对其相对表达量进行统计学分析。原位末端转移酶标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)检测 Sham 组和模型组 WT 与 Nlrc5-/-小鼠肾脏细胞死亡情况,并进行统计学分析。使用Caspase3活性检测试剂盒检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏中Caspase3的活性。1.2.3 WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏组织炎症反应相关指标的检测采用Real-time RT-PCR检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏组织中炎症因子的mRNA水平。IF检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏肾脏组织中四种免疫细胞的浸润情况,包括中性粒细胞标记蛋白-Ly6B,巨噬细胞标记蛋白-CD68,CD4+T细胞标记蛋白-CD4以及树突状细胞标记蛋白-CD11c。1.2.4沉默NLRC5的表达对低氧培养诱导的NRK-52E细胞炎症及凋亡的影响Real-time RT-PCR检测siRNA沉默NLRC5后在低氧培养条件下NRK-52E细胞中炎性因子表达水平。采用AnnexinV/PI染色,通过流式细胞术检测siRNA沉默NLRC5对低氧培养条件下NRK-52E细胞凋亡的影响。第二部分NLRC5通过调控CEACAM1信号通路导致肾缺血再灌注损伤的分子机制2.1 NLRC5对CEACAM1表达的影响使用安捷伦小鼠全基因组表达谱芯片(Agilent Whole Mouse Genome OligoMicroarray for global gene expression analysis)分析 WT 与 Nlrc5-/-小鼠差异基因。Real-time RT-PCR 检测 WT 与 Nlrc5-/-小鼠肾脏 CEACAM1的 mRNA 水平。WB 和 IF检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏CEACAM1的蛋白水平。WB检测si-RNA沉默NLRC5对低氧培养条件下NRK-52E细胞中CEACAM1蛋白表达的影响。IF方法检测NRK-52E细胞和CD4+ T细胞中NLRC5和CEACAM1的蛋白表达水平。2.2肾小管上皮细胞NLRC5-CEACAM1信号通路对MAPK/ERK和PI3K/Akt通路激活的影响WB检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路激活情况。WB检测si-RNA沉默NLRC5和CEACAM1对低氧培养条件下NRK-52E细胞中MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的影响。2.3 NLRC5对CD4+ T cell激活和增殖的影响流式细胞术(Flow cytometry,FC)检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏和脾脏中CD4+T细胞的比例。流式细胞术检测WT与Nlrc5-/-小鼠脾脏中CD4+ T细胞的激活情况。使用美天旎免疫磁珠提取脾脏中的CD4+T细胞,取2×1O5分离的CD4+T细胞,加入到含有板包被的1μg/ml CD3抗体、游离的1μμg/mlCD28抗体以及rIL-2的96孔板中,在含有5%CO2培养箱中培养72h,检测CD4+T细胞的激活情况。取2×105个分离的CD4+T细胞,加入到含有板包被的5μg/mlCD3抗体、游离的2μg/mlCD28抗体的96孔板中,在含有5%CO2培养箱中培养72h,流式检测,细胞事先用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein succinimidyl ester,cfse)标记。2.4 CEACAM1对CD4+ T cell激活和增殖的影响使用腺病毒作为载体,沉默CD4+T细胞中的CEACAM1的表达,用流式细胞术检测沉默效率。取2×105分离的CD4+ T细胞,加入到含有板包被的1μg/ml CD3抗体、游离的1μg/ml CD28抗体以及rIL-2的96孔板中,在含有5%CO2培养箱中培养72h,流式细胞术检测WT、Nlrc5-/-以及Nlrc5-/-+shRNA-CEACAM1组中CD4+ T细胞的激活情况以及IFN-γ释放情况。使用CFSE检测各个组的细胞增殖情况。2.5肾脏实质细胞和骨髓造血细胞中NLRC5缺失对肾脏缺血再灌注损伤的影响使用致死剂量的x射线对WT与Nlrc5--小鼠照射,清除小鼠的骨髓,6小时后进行骨髓造血细胞移植,构建骨髓嵌合体小鼠。6周后对嵌合体小鼠构建肾缺血再灌注模型,采用HPLC系统检测WT与Nlrc5--小鼠血清中肌酐的含量。采用HE染色法检测WT与Nlrc5--小鼠肾脏形态学损伤情况,并进行评分。IF检测KIM-1在WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏中的表达情况,并对其相对表达量进行统计学分析。第三部分NLRC5在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及机制3.1 NLRC5在顺铂诱导的小鼠AKI中的作用3.1.1构建顺铂诱导的小鼠AKI模型及NLRC5表达的检测选取12周龄WT(C57BL/6)雄性小鼠和Nlrc5-/-雄性小鼠,通过腹腔注射顺铂(剂量30mg/kg体重)构建小鼠AKI模型。WB检测顺铂注射后各时间点WT小鼠肾脏组织中NLRC5的蛋白水平。3.1.2 NLRC5缺失对顺铂诱导的AKI的影响采用全自动生化分析仪检测WT与Nlrc5-/-小鼠血清中尿素氮的含量。采用高HPLC法检测WT与Nlrc5-/-小鼠血清中肌酐的含量。采用HE染色法检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏形态学损伤情况,并进行评分。TUNEL染色检测WT与Nlrc5--小鼠肾脏细胞凋亡情况,并进行统计学分析。Real-time RT-PCR检测WT与Nlrc5--小鼠肾匀浆中促炎因子的mRNA含量。WB检测顺铂诱导下NRK-52E细胞中NLRC5蛋白水平的变化。流式细胞术检测检测沉默NLRC5对顺铂诱导NRK-52E细胞凋亡的影响。3.1.3检测在顺铂诱导的急性肾损伤中NLRC5对CEACAM1表达的影响WB检测WT与Nlrc5-/-小鼠肾脏CEACAM1的蛋白水平。研究结果第一部分NLRC5在肾缺血再灌注损伤中的作用1.1 NLRC5在急性肾缺血再灌注损伤中的表达显著升高1.1.1小鼠组织器官和肾脏细胞系中NLRC5的表达通过RT-PCR检测发现,NLRC5在脾和胃中高表达,在肾脏中有表达。进一步检测小鼠肾脏细胞系,包括小鼠足细胞(MPC)、大鼠近曲小管上皮细胞(NRK-52E)、大鼠肾小球系膜细胞(RMC)和大鼠肾小球内皮细胞(GENC)中NLRC5的mRNA表达水平,结果表明NLRC5在NRK-52E细胞中高表达。1.1.2小鼠肾缺血再灌注损伤模型肾脏组织中NLRC5表达显著升高Real-time RT-PCR及WB检测小鼠肾脏组织中NLRC5的mRNA和蛋白水平。结果显示,模型组小鼠肾脏组织中NLRC5的mRNA与蛋白水平较Sham组显著升高,并且随着再灌注时间延长表现出时间依赖性,IHC数据证实了上述实验结果,并且表明NLRC5表达升高主要集中于肾小管中。1.1.3 NLRC5主要表达于近曲小管与远曲小管中IF结果表明,NLRC5主要表达在肾皮质与外髓质的近曲小管和远曲小管中,并且在缺血再灌注损伤肾脏组织中的表达明显升高;在髓质集合管中表达较弱,且在缺血再灌注损伤肾脏组织中的表达无明显变化。1.1.4 NLRC5表达于肾脏浸润的免疫细胞中IF检测发现,NLRC5在缺血再灌注肾脏浸润的巨噬细胞,中性粒细胞,CD4+T细胞和树突状细胞中均有表达。1.1.5 NLRC5在急性肾小管坏死病人肾脏中的表达升高IHC检测发现,在急性肾小管坏死病人的肾脏组织切片中发现NLRC5的表达明显高于肾癌病人癌旁组织。1.1.6体外低氧培养条件下肾小管上皮细胞NLRC5的蛋白水平显著升高体外培养NRK-52E细胞,采用低氧培养、抗霉素A/2-脱氧葡萄糖、CoCl2处理模拟体内低氧环境。WB结果表明,三种处理条件下,NLRC5的蛋白水平均显著升高。1.2 NLRC5缺失在肾缺血再灌注损伤中具有保护作用1.2.1 NLRC5缺失减轻肾缺血再灌注损伤模型组中,Nlrc5-/-小鼠血清中肌酐和尿素氮水平较WT小鼠明显降低;肾脏形态学损伤明显减轻,KIM-1的表达明显减少,细胞死亡数显著减少;肾脏组织匀浆中炎症因子的mRNA水平明显降低,浸润的中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和CD4+ T细胞的数量明显减少。1.2.2 NLRC5缺失减轻了低氧诱导的NRK-52E细胞的炎症反应与凋亡NLRC5缺失显著抑制了低氧诱导的NRK-52E细胞中的炎性反应和凋亡细胞的增多。第二部分NLRC5通过调控CEACAM1信号通路致肾缺血再灌注损伤的分子机制2.1 NLRC5负调控CEACAM1的表达在肾缺血再灌注损伤中的CEACAM1的表达明显降低,NLRC5的缺失恢复了肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏中CEACAM1蛋白水平的降低。低氧诱导的NRK-52E细胞中CEACAM1的表达明显降低,使用si-RNA沉默NLRC5可以恢复低氧诱导下NRK-52E细胞中CEACAM1的降低。2.2 NLRC5负调控CEACAM1介导的下游信号通路在肾缺血再灌注损伤肾脏组织中ERK1/2和PI3K/Akt信号通路明显激活,NLRC5的缺失可以进一步激活ERK1/2信号通路,而对PI3K/Akt信号通路无明显影响。在体外低氧培养条件下NRK-52E细胞中ERK1/2和PI3K/Akt信号通路明显激活,基因沉默NLRC5可以进一步激活ERK1/2和PI3K/Akt信号通路,使用si-RNA同时沉默NLRC5和CEACAM1的表达可以下调NLRC5缺失而诱导的ERK1/2和PI3K/Akt信号通路的激活,表明在肾小管上皮细胞中NLRC5负调控CEACAM1介导的下游信号通路。2.3 NLRC5可以诱导缺血再灌注损伤肾脏组织中CD4+T细胞的浸润和激活在肾缺血再灌注条件下,NLRC5缺失型小鼠肾脏和脾脏中的CD4+ T细胞数量明显减少,CD4+T细胞的激活收到抑制,表明NLRC5可以诱导缺血再灌注损伤肾脏中CD4+ T细胞的浸润和激活。2.4 NLRC5通过调控CEACAM1信号通路激活CD4+ T细胞体外实验中,NLRC5缺失可以抑制CD3/CD28抗体诱导的CD4+ T细胞的激活和增殖。使用腺病毒作为载体,沉默CD4+T细胞中的CEACAM1的表达,发现CEACAM1沉默可以逆转NLRC5的缺失对CD4+ T细胞的激活和增殖的抑制,增加CD4+IFN-γ+细胞的数量,表明NLRC5通过调控CEACAM1信号通路激活CD4+ T细胞。2.5 NLRC5缺失对肾脏实质细胞和射线敏感的造血细胞的影响通过对骨髓嵌合体小鼠构建肾缺血再灌注模型,检测肾脏损伤情况发现,Nlrc5-/-→WT嵌合体小鼠肾脏损伤程度高于WT体Nlrc5-/-嵌合体小鼠,说明NLRC5的缺失在肾脏实质细胞中的保护作用高于射线敏感的造血细胞。第三部分NLRC5在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及机制3.1 NLRC5在顺铂诱导的急性肾损伤中表达显著升高通过对WT小鼠腹腔注射顺铂构建AKI模型,WB检测结果显示,NLRC5在顺铂诱导的AKI肾脏组织中蛋白表达显著升高。体外培养NRK-52E细胞,给予顺铂刺激,WB检测结果显示,顺铂刺激后细胞中NLRC5的蛋白表达显著升高。3.2 NLRC5的缺失可以减轻顺铂诱导的急性肾损伤通过对WT和Nlrc5-/-小鼠腹腔注射顺铂构建AKI模型,检测NLRC5对顺铂诱导的AKI的作用。血清肌酐尿素氮检测结果表明,与WT模型组相比,Nlrc5--模型组血清肌酐尿素氮水平明显降低。HE染色结果表明NLRC5的缺失可以明显减轻顺铂诱导的肾脏组织损伤。TUNEL染色和FC结果显示,NLRC5的缺失可以明显减轻顺铂诱导的肾脏细胞凋亡。Real-timeRT-PCR检测结果显示,NLRC5的缺失可以减轻顺铂诱导的炎性反应。以上结果表明,NLRC5的缺失可以减轻顺铂导致的急性肾损伤。3.3顺铂诱导的急性肾损伤中NLRC5的缺失可以上调CEACAM1的表达WB检测结果显示,NLRC5的缺失可以上调CEACAM1的表达,表明NLRC5对CEACAM1表达的调控在不同致病因素引起的急性肾损伤中具有普遍性。研究结论与创新性1.本研究首次阐明了 NLRC5在急性肾损伤中的作用,发现在缺血再灌注和顺铂诱导的急性肾损伤中,NLRC5的表达明显升高。NLRC5的缺失可以通过减轻肾小管细胞的凋亡,炎性细胞的浸润和炎性因子的释放进而减轻急性肾损伤。2.本研究发现NLRC调控CEACAM1信号通路,影响其下游的ERK1/2和PI3K/Akt信号通路从而加重缺血再灌注引起的肾小管上皮细胞的损伤。同时NLRC5还可以通过调控CEACAM1的表达调控小鼠CD4+T细胞激活和增殖。进一步通过骨髓移植实验证明了 NLRC5在肾脏实质细胞中的作用更为重要。本研究有助于进一步阐明模式识别受体在小鼠AKI中的作用,拓宽对于NLRC5在固有免疫和获得性免疫中作用的认识,为寻找和发现防治急性肾损伤的靶点提供了重要的理论和实验基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【图文】：

ＲＴ－ＰＣＲ检测小鼠各个组织器官，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胃和小肠组织逡逑在内的ＮＬＲＣ５的ｍＲＮＡ水平，结果表明ＮＬＲＣ５在脾和胃中高表达，在肾脏中有逡逑较高表达（图１．１ａ）。进一步检测小鼠肾脏细胞系，包括小鼠足细胞（ＭＰＣ）、大鼠逡逑近曲小管上皮细胞（ＮＲＫ－５２Ｅ）、大肾小球系膜细胞（ＲＭＣ）和大鼠肾小球内皮细逡逑胞（ＧＥＮＣ）中ＮＬＲＣ５的ｍＲＮＡ水平，结果表明ＮＬＲＣ５在ＮＲＫ－５２Ｅ细胞中高表逡逑达（图邋１．１ｂ）。逡逑ＮＬＲＣ５逦ＮＬＲＣ５逡逑（３－Ａｃｔｉｎ逦３－Ａｃｔｉｎ逡逑ＩｌｉｌｌｌｉＪｉ邋ｆｊｌＬｌ逡逑１彟f�着邋ｚ逡逑图１．１邋ＮＬＲＣ５在小鼠组织器官和肾脏细胞系中的表达。ａ邋ＲＴ－ＰＣＲ检测小鼠组织器官中ＮＬＲＣ５逡逑的ｍＲＮＡ表达水平。ｂ邋ＲＴ－ＰＣＲ检测肾脏细胞系中ＮＬＲＣ５的ｍＲＮＡ表达水平。逡逑１．２肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏组织中ＮＬＲＣ５的表达显著升高逡逑Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ（图１．２ａ）以及ＷＢ（图１．２ｂ）结果显示，模型组与假手术（Ｓｈａｍ）逡逑组相比，小鼠肾脏组织中ＮＬＲＣ５的ｍＲＮＡ水平和蛋白水平明显升高，并且随着再逡逑灌注时间的延长，ＮＬＲＣ５表达升高呈现时间依赖性。ＩＨＣ检测（图１．２ｃ）小鼠肾脏逡逑组织中ＮＬＲＣ５的蛋白表达，发现模型组与Ｓｈａｍ组相比，小鼠肾脏组织中ＮＬＲＣ５逡逑的蛋白表达水平明显升高，并随着再灌注时间的延长呈现明显的时间依赖性，且主逡逑４７逡�

本文编号：2794587