肾移植术后BK病毒相关性肾病和急性细胞性排斥的病例比较分析及其基于蛋白芯片的差异细胞因子筛选

发布时间：2020-08-20 08:01

【摘要】：第一部分 BK病毒相关性肾病与T细胞介导的急性排斥反应的临床特征、预后比较及辅助诊断模型的建立背景与目的:随着新型免疫抑制剂的使用,BK病毒感染高发,其导致的BK病毒相关性肾病(BK virus-associated nephropathy,BKN)已经成为移植肾失功的重要原因之一。其临床和病理表现需与T细胞介导的急性排斥反应(acute T-cell mediated rejection,TCMR)进行鉴别。目前对于BKN和TCMR的临床特点和预后进行综合比较分析的报道较少,且BKN的诊断金标准SV40大T抗原染色法有一定局限性,造成BKN和TCMR的鉴别困难。本课题通过对BKN和TCMR病例的回顾分析,总结和比较两者的临床、病理特征和预后影响因素,并建立起辅助SV40大T抗原染色法的鉴别诊断模型。方法:本研究纳入2011.1月至2018.3月期间,在浙江大学附属第一医院行移植肾穿刺且病理活检证实为BKN(n=54人)和TCMR(n=237人)的病例。收集临床基线资料、病理组织的免疫细胞浸润评分、实验室检查和长期随访情况等,使用Kaplan.Meier法和多因素COX回归模型绘制BKN组和TCMR组的生存曲线,比较两组的预后。采用多因素COX回归模型分别筛选出影响BKN组和TCMR组累计移植肾存活率的独立危险因素。最后利用二元Logistic回归模型,以病理SV40染色阳性确诊为BKN为终点变量,将各变量纳入模型中,筛选出支持诊断BKN的预测因子,建立新的诊断预测模型,并绘制ROC曲线。结果:本研究共纳入BKN患者54例(平均年龄40.2±10.6岁,女性占40.7%)和TCMR患者237例(平均年龄40.1±12.1岁,女性32.9%)。在基线资料上,BKN组尿常规中红细胞数要显著低于TCMR组[4.9(2,10.25)VS 8.2(3.8,22.6)(个/μL),P=0.0066)],BKN 组的尿蛋白要轻于 TCMR 组[0(0,0.2)VS 0.2(0.045,0.49)(g/L),P0.0001]。BKN组的血红蛋白和血清白蛋白水平要显著高于TCMR组[HB(g/L):120.4±19.6 VS 110.8±22.6,P=0.0042][Albumin(g/L):45.0±7.0 VS 41.3±7.1,P0.0001]。BKN 组的总胆固醇水平要高于 TCMR 组(4.6±1.0 VS 4.3±1.0,P=0.022)(mmol/L)。BKN组使用诱导剂(IL-2受体拮抗剂或ATG)的比例要显著高于TCMR组(P=0.0021)。BKN组的基线他克莫司的浓度显著高于TCMR组(8.6±6.9 VS 6.0±2.7,P=0.0014)(μg/L)。病理上,BKN 组病理组织片中α-SMA、CD3、CD68重度阳性的比例要显著高于TCMR组(P0.05)。通过对随访期间的肾功能比较,发现BKN组总体的肾功能要差于TCMR组。Kaplan.Meier法绘制两者生存曲线,发现TCMR组的移植肾中位生存时间为2166(1767.7,2564.3)天,BKN组的中位移植肾生存时间为1800(898.3,2701.6)天,Log Rank检验P=0.06。多因素COX回归分析模型在调整了肾移植术后时间、基线eGFR、血清白蛋白、PRA等因素后,发现BKN组相对于TCMR组,累计移植肾存活率显著下降(P=0.002)。多因素COX回归分析模型对BKN组的预后进行单独分析后提示:尿蛋白水平(OR=6.786,95%CI:2.170-21.220,P=0.001)、激素冲击治疗史(OR=2.831,95%CI:1.338-5.990,P=0.006)、病理组织片 CD3阳性细胞浸润程度(OR=5.610,95%CI:1.400-22.482)是BKN组患者累计移植肾生存率的独立危险因素。多因素COX回归模型对TCMR组的预后进行单独分析后提示:PRA-I 类抗体水平(OR=3.972,95%CI:1.440-10.956,P=0.008)、低血清白蛋白(OR=2.146,95%CI:1.011-4.557,P=0.047)和基线肾功能的CKD分级(OR=2.713,95%CI:1.803-4.081,P0.0001)是 TCMR 组患者累计移植肾生存率的独立危险因素。最后,本文利用二元Logistic回归模型和ROC曲线建立起BKN与TCMR的鉴别诊断模型,以辅助SV40染色法诊断BKN,该模型的预测概率的截断值为0.179,灵敏度为96.3%,特异度为90.6%,预测正确率为96.1%。该公式表达式为:P(Y=1|X)=1/1+e6.617-1.034*X1+1.55*X2-0.681*X3其中(X1为病理组织片中CD20阳性细胞的浸润程度分级,X2为初诊时尿蛋白水平分级,X3为尿液BK病毒DNA拷贝数以10为底的对数值)结论:相比于TCMR患者,BKN患者具有更轻微的尿蛋白和尿红细胞水平。两者病理组织片炎症浸润情况类似,但BKN组病人的α-SMA、CD3、CD68阳性细胞重度浸润的比例要高于TCMR组。BKN组患者随访期间的肾功能和移植肾生存率要显著差于TCMR组。最后本文建立起BKN与TCMR的鉴别诊断预测模型。第二部分 BK病毒相关性肾病和T细胞介导的急性排斥反应基于蛋白芯片的血清差异细胞因子筛选背景与目的BK病毒相关性肾病(BK virus associated nephropathy,BKN)与T细胞介导的急性排斥反应(acute T-cell mediated rejection,TCMR)两者的临床和病理表现较为相似。目前学界已经有一些研究试图从分子水平对BKN和TCMR进行表征。有文献报道两者的外周血及肾穿组织的转录组水平差异,少数报道了小分子代谢物以及血液尿液中个别细胞因子在BKN和TCMR中的鉴别诊断作用,至今尚无对于BKN和TCMR基于血清高通量细胞因子的研究。本研究拟从血清细胞因子水平对BKN与TCMR进行表征分析,筛选出差异表达的细胞因子,以期帮助更好地理解和区分BKN和TCMR两个疾病的过程,为将来分子标志物的筛选提供线索。方法:本实验收集对象为在浙江大学附属第一医院行肾移植手术并且规律在我院门诊随访的患者,在2014.1.1至2016.1.1期间收集了 8例BKN患者,8例TCMR患者和8例肌酐稳定患者的血清样本,利用RayBiotech公司提供的GSH-CAA-440细胞因子芯片进行检测。结果:本研究利用细胞因子芯片对8例BKN患者、8例TCMR患者和8例肾移植术后肌酐稳定患者的血清进行差异细胞因子的筛选,三组人口统计学资料无显著差异。研究发现BKN组相比TCMR组,共有29个差异细胞因子,有6个蛋白表达上调,为ANG-4、CXCL-14等;有23个蛋白表达下调,为IL-2 Ra、IL-23、IL-21等,这些蛋白集中在细胞因子信号识别通路、感染相关通路、HIF-1通路、Th17细胞分化通路、JNK-STAK通路、IL17相关信号通路等;BKN组相比于肌酐稳组,共有61个差异细胞因子,以肌酐稳定组为对照,BKN组有25个细胞因子表达上调,如ANG-4、G-CSF R等,有36个细胞因子表达下调,如BMPR-IB、Cadherin-13等。这些差异蛋白集中在PI3K-Akt通路、MAPK通路、JAK-STAT通路、感染、RAS信号通路等;TCMR组相比于肌酐稳定组,共有17个差异细胞因子,以肌酐稳定组为对照,TCMR组有15个细胞因子表达上调,如NT-4、MMP-8等,有2个细胞因子表达下调,为CXCL14和Midkine,这些差异蛋白集中在细胞因子信号识别通路、IL-17信号通路、TNF通路等。结论:本次结果提示PI3K-Akt通路、MAPK通路、JAK-STAT通路、感染、RAS信号通路可能与BKN的发病机制有关,而细胞因子信号识别通路、IL-17信号通路、TNF通路可能与TCMR的发病有关。本次筛选出的29个差异蛋白有可能作为鉴别BKN和TCMR组的潜在分子标志物。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R699.2
【图文】：

流程图,研究对象,流程图,病理活检

法逡逑对象逡逑月至２０１８．３月期间，在我院行移植肾穿刺，病理活检证实斥反应和ＢＫ病毒相关性肾病的患者。逡逑岁逡逑植手术相关基线资料，如配型、移植类型、免疫制剂等逡逑信息和随访信息逡逑筛选流程如图１逡逑

移植肾,免疫细胞,病理,放大倍数

－邋，逡逑图２邋ＢＫＮ组和ＴＣＭＲ组移植肾肾穿组织病理片内免疫细胞浸润情况，图２．Ａ为逡逑ＢＫＮ组，图２．Ｂ为ＴＣＭＲ组，放大倍数为２００倍。逡逑１７逡逑

尿素氮,肌酐,肾功能,缓慢上升

人年）逡逑注释，随访天数指的是肾穿时间点后到最近的登记的一次随访时间差；ｎｓ：邋Ｐ２０．０５）逡逑ＢＫＮ组和ＴＣＭＲ组随访时间内的肾功能变化如图３所示，随访截止时间为逡逑２０１９年３月１号，如图３所示。总体上看，ＴＣＭＲ组的尿素氮和血清肌酐在随访逡逑期间呈现先下降后缓慢上升的趋势，而ＢＫＮ组的尿素氮和肌酐呈现缓慢上升的趋逡逑势。ＴＣＭＲ组和ＢＫＮ组的平均ｅＧＦＲ水平在０－３个月内有小幅上升，之后又缓慢逡逑下降。从这三个指标可以发现，在随访期间Ｂ邋ＫＮ组的平均肾功能要略微差于ＴＣＭＲ逡逑组，且在多个时间点上存在着统计学差异。逡逑２０逡逑

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