基于适配体识别作用的前列腺肿瘤外泌体的电化学信号放大检测
发布时间：2020-08-27 23:02
【摘要】：液体活组织检查,也称为液体活检或液相活组织检查,是对非固体生物组织,主要是血液的采样和分析。与传统活检相比,液体活检是一种非侵入性、无创的技术,它可以在一段时间内频繁的进行,能更好的跟踪肿瘤和突变。目前液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞(CTCs),循环RNA(Circulating RNA),循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片和外泌体(携带有细胞来源相关的多种蛋白质,脂类,DNA,RNA等)。外泌体在数量上多于CTCs,更容易富集,在形式上分泌的小泡能够有效保护核酸类物质,克服了 ctDNA在血液中易降解的问题,在临床上有广泛的应用前景。外泌体的直径在30-150 nm之间,是由胞吐作用释放到细胞外的纳米级细胞外脂质双层囊泡。它能够将一些功能信息传递到相邻的细胞或是较远的细胞中,从而能够实现细胞间的通讯。由于外泌体在体液中,尤其是血液中的含量丰富及良好的稳定性,已经被认为是癌症循环生物标志物的可靠来源。其所携带的肿瘤特异性蛋白和miRNA可以作为肿瘤诊断标志物,可用于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等疾病的检测。目前,对外泌体的检测主要基于抗体、适配体对蛋白质的特异性识别。与抗体相比,适配体是一段DNA或RNA的序列,它能够与目标物高特异性、高选择性的结合,而且不易受pH、温度等环境因素的影响。本文利用电化学方法,基于适配体与蛋白质之间的特异性结合,实现了癌细胞来源的外泌体的检测。本课题旨在建立非侵入性的癌症检测方法,为早期的诊断和治疗提供理论依据。1.建立了一个基于适配体特异性识别,纳米金颗粒负载DNA用于信号放大的电化学方法来检测前列腺癌细胞来源的外泌体。在这个工作中,CD63核酸适配体作为探针修饰到金电极上,用于与外泌体膜上的四跨膜蛋白CD63特异性识别,使得外泌体能够固定到金电极上。AuNPs-aptamer为金纳米粒子上修饰了 CD63适配体,一方面是用于与电极上的外泌体特异性识别,使AuNPs-aptamer修饰到电极上。另一方面,AuNPs-aptamer上携带了大量DNA,DNA的磷酸骨架带负电,可以吸附更多的活性物质RuHeX,起到增强信号的作用。实验证明,该生物传感器对于外泌体检测的线性范围为9.15×104particle/mL到3.25×107 particle/mL,检出限可以达到3.568×104 particle/mL。许多癌细胞分泌的外泌体都会携带四跨膜蛋白CD63,因此,我们构建的生物传感器具有普遍的适用性,对临床相关疾病的早期诊断具有重要的指导意义。2.建立了一个基于HCR信号放大的方法来检测前列腺癌细胞来源的外泌体。PSMA为前列腺癌细胞的特异性蛋白,母细胞分泌的外泌体上会大量表达这种蛋白。我们设计了两个发夹型的DNA,在引发链(CD63适配体的一端连接了可以引发发夹型DNA杂交的序列)的存在下,可以引发HCR。PSMA核酸适配体作为固定在电极上的探针,在目标物存在的条件下,可以与外泌体上的PSMA蛋白特异性结合,使外泌体捕获在电极上。同时,外泌体的膜上也会表达CD63蛋白,引发链的一端为CD63适配体的序列,用于与外泌体上的CD63蛋白结合;另一端的序列能够引发链反应,形成自主装的DNA纳米结构,这个结构能吸附更多的RuHeX到DNA的磷酸骨架上,起到信号放大的作用,使得该生物传感器具有较高的灵敏度。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.1;R737.25
【图文】：
不同的蛋白质，这些蛋白质在外泌体的分离和定量检测中扮演着重要的角色。例如，逡逑外泌体膜上的四跨膜蛋白（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１）可以提供特异性识别的位点与抗体逡逑结合。图１．１详细展示了外泌体的组成结构ｍ。外泌体广泛存在于各种体液中，如血逡逑浆、血清、唾液、尿液和精液［８＿１１］。在最初的研宄中，外泌体被视为是运输细胞不必逡逑要蛋白质的“垃圾袋”，但后来的研[偡⑾郑饷谔迨窍赴匾煨苑置诘哪遗荩芄唤义弦恍┕δ苄畔⒋莸较嗔诘南赴蚴墙显兜南赴校佣芄唤邢赴涞耐ㄑ丁Ｄ稿义舷赴置诘耐饷谔逍烁髦痔囟ǖ暮塑账岷偷鞍字剩梢晕琢鲈诹俅采系恼锒咸徨义瞎┯屑壑档男畔ⅰＭ饷谔蹇梢宰魑庖哂Υ鸬拇俳粒诳乖实葜蟹⒒幼胖匾淖麇义嫌茫郏保玻撸保常荨ＯΣ访谔宀唤隹梢蕴匾煨缘卣攵允芴逑赴换坏鞍字屎椭剩箍梢杂肽勘晔苠义咸逑赴⑸匾煨缘南嗷プ饔
本文编号：2806726
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.1;R737.25
【图文】：
不同的蛋白质，这些蛋白质在外泌体的分离和定量检测中扮演着重要的角色。例如，逡逑外泌体膜上的四跨膜蛋白（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１）可以提供特异性识别的位点与抗体逡逑结合。图１．１详细展示了外泌体的组成结构ｍ。外泌体广泛存在于各种体液中，如血逡逑浆、血清、唾液、尿液和精液［８＿１１］。在最初的研宄中，外泌体被视为是运输细胞不必逡逑要蛋白质的“垃圾袋”，但后来的研[偡⑾郑饷谔迨窍赴匾煨苑置诘哪遗荩芄唤义弦恍┕δ苄畔⒋莸较嗔诘南赴蚴墙显兜南赴校佣芄唤邢赴涞耐ㄑ丁Ｄ稿义舷赴置诘耐饷谔逍烁髦痔囟ǖ暮塑账岷偷鞍字剩梢晕琢鲈诹俅采系恼锒咸徨义瞎┯屑壑档男畔ⅰＭ饷谔蹇梢宰魑庖哂Υ鸬拇俳粒诳乖实葜蟹⒒幼胖匾淖麇义嫌茫郏保玻撸保常荨ＯΣ访谔宀唤隹梢蕴匾煨缘卣攵允芴逑赴换坏鞍字屎椭剩箍梢杂肽勘晔苠义咸逑赴⑸匾煨缘南嗷プ饔
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