弱精症患者精液精子中miR-525-3p及其靶基因SEMG1表达水平变化及其临床意义研究

发布时间：2020-08-28 05:25

【摘要】：据世界卫生组织统计,目前全球约有10%-15%的育龄夫妇存在生育问题,不孕不育症成为全世界关注的焦点问题,在这些病例中男性因素引起的不育约占50%[1-3]。可怕的是,精子密度和精子活力每年都在以一定程度的降低,这可能与日益增长的环境污染的有关[4]。根据世界卫生组织(WHO)指南(第5版),弱精症(弱精子症)的特征是新鲜精液中的精子数量正常但精子活力降低。弱精子症可能是泌尿生殖系统感染,精索静脉曲张异常,精液液化,激素异常等原因造成的结果[5,6]。然而,在一些弱精子症中,大约50%的病因未被发现,这被称为特发性男性不育症[2]。特发性弱精子症的发病机制尚不清楚,这阻碍了弱精子症的诊断和治疗进展。迄今为止,一些研究表明,某些关键基因的差异表达与弱精症的发生发展密切相关。目前已经明确与弱精症发生发展密切相关的基因或蛋白包括纤毛和鞭毛相关蛋白69(CFAP69)、富含半胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2)等,这些蛋白的差异表达同样可以导致小鼠的弱精症发生[7,8]。此外,我们前期研究通过基因芯片技术已经确定semenogelin 1(SEMG1)是特发性弱精子症的潜在标志物[9]。SEMG1是男性精液中的主要分泌蛋白,来源于精囊,射精后形成凝胶基质,包裹射精后精子,前列腺特异性抗原(PSA)将其降解为较小的肽,这使得精子能够获得运动能力并快速移动[10]。Martinez-Heredia等[11,12]使用二维蛋白质组学分析鉴定出多种弱精子症精液样品中差异表达的蛋白质,其中包含SEMG1蛋白的高表达。一致地,我们之前的研究通过检测弱精子症患者和正常精子的基因表达谱分析提示弱精子症患者中SEMG1高表达,这提示SEMG1在弱精子症的发生发展过程中起到重要作用[9]。然而,弱精子症患者中SEMG1高表达的分子机制尚不清楚。基因的表达通常由遗传和表观遗传学共同调控[13]。micrRNAs(miRNA)在基因的表达调控方面发挥着重要的作用,因此在许多生物学过程中起到至关重要的作用[14,15]。研究发现miRNA不仅表达于哺乳动物的睾丸及生殖细胞[16,17][18],在人的精液精子中也检测到各种miRNAs的存在[19],这些miRNAs的生物学功能有待进一步研究[20,21]。在精子的发生发展过程中存在广泛的miRNA,研究表明miRNA在精原细胞的形成以及精原细胞向精母细胞的分化过程可以通过调控关键基因的表达维持正常的生物学进程[22-25]。我们前期发现SEMG1基因在弱精子症患者精液精子中高表达,然而,目前仍不清楚精子中miRNA是否参与调控弱精症精子中SEMG1的表达调控,本研究旨在明确何种miRNA参与调控SEMG1的表达介导弱精子症发生。在本研究中,我们检测了弱精症和正常精液精子中SEMG1和miR-525-3p的表达水平。同时,我们发现高SEMG1表达分别与异常形态,低精子活力和男性不育相关。我们的研究结果表明,miR-525-3p缺失可导致SEMG1的异常表达并且与男性不育密切相关,这为治疗男性不育或男性避孕提供了可能的靶点。方法和结果:1.弱精症患者和正常精子基本参数的比较我们比较了 30名弱精子症患者和30名年龄匹配的正常精子志愿者的精液常规参数。在年龄,精子量,pH和精子浓度方面,弱精子症患者和正常精子志愿者之间没有显着差异。值得注意的是,与正常精子组相比,弱精子症患者的精子前向运动能力和正常形态占比明显降低。2.弱精症患者和正常志愿者精液精子中SEMGl mRNA和蛋白表达水平检测。分别利用qPCR及WB技术在弱精子症患者和正常志愿者的精液精子中检测SEMG1mRNA和蛋白质表达水平。结果显示,与正常精液精子相比,弱精症患者精液精子中SEMG1 mRNA的表达水平显着升高(1.40±0.35 VS 0.46±0.23,p0.001)。同样,免疫蛋白质印迹分析也表明SEMG1蛋白在弱精症患者精液精子中的表达水平明显升高(弱精症组VS正常组,P0.001)。3.miR-525-3p在弱精症患者精液精子中低表达,并可以通过与SEMG1的3'-UTR结合直接抑制SEMG1蛋白的表达。我们使用miRWalk2.0、MiRanda、RNA22、Targetscan四个数据库来预测可能靶向SEMG1基因3'-UTR区的miRNA。通过生物信息学分析,我们筛选出了六个候选的 miRNA(miR-525-3p,miR-524-3p,miR-133b,miR-671-5p,miR-133a-3p和miR-130a-5p)。然后通过qRT-PCR定量检测了正常对照组及弱精症组精液精子中这些候选的miRNA的表达水平。有趣的是,我们发现在弱精子症患者的射精精子中miR-525-3p的表达水平低于正常精子对照(1.22±1.00对比0.64±0.55,P=0.007),而其他5个miRNA在正常精子与弱精子症精子中表达无明显差异。这一结果提示,精液精子中miR-525-3p和SEMG1之间可能存在潜在关联。为了进一步证实miR-525-3p是否能特异性调节SEMG1表达,我们进行了双荧光素酶报告基因实验。当用miR-525-3pmimic与含SEMG1的3‘UTR的质粒共转染293T细胞时,观察到荧光素酶活性受到明显的抑制。综上所述,miR-525-3p可通过靶向调控SEMG1蛋白的表达参与弱精症的发生。4.精子中miR-525-3p和SEMG1 mRNA表达水平与精子的参数相关性分析我们对精子中miR-525-3p及SEMG1 mRNA表达水平与临床精液常规参数的相关性进行了统计分析。结果表明,miR-525-3p表达水平与精子活力和正常形态率呈正相关。相反,SEMG1 mRNA表达水平与精子活力和正常形态率呈负相关。此外,miR-525-3p或SEMG1 mRNA的表达水平与其他精子参数(如精液量和精子浓度、PH值等)无关。5.临床精液样本精子中miR-525-3p和SEMG1蛋白的表达水平成负相关通过双荧光素酶报告基因实验检测,我们初步证实了miR-525-3p可以靶向结合SEMG1基因的3'UTR区。为进一步探讨临床精液样本精子中miR-525-3p和SEMG1蛋白表达量之间的相关性,我们随机选取60例纳入者中的39例临床精液样本进行检测(其中19例弱精症患者精液标本;20例正常精液样本)分析,结果显示精液样本精子中miR-525-3p表达水平和SEMG1蛋白的表达水平呈负相关(图2-5,p=0.0341 r=-0.3401);综上所述,miR-525-3p可通过靶向调控SEMG1蛋白的表达参与弱精症的发生。6.精子中miR-525-3p和SEMGl mRNA表达水平与男性生育力的相关性分析为了探索miR-525-3p或SEMG1 mRNA表达与弱精子症的临床相关性,我们对所有参与者的生育史进行了为期1年的随访研究。在所有的研究对象中,12名受试者被排除在我们的研究之外。排除的受试者包括失去联系或拒绝合作(n=9),未婚(n=1)和女性伴侣不育(n=2)。最后,本研究将21名弱精子症患者和27名正常精子志愿者纳入生育能力研究。随后,我们根据其精子中miR-525-3p或SEMG1 mRNA的表达水平将受试者分为相对高表达组和相对低表达组。结果显示正常精子组的生育率高于弱精子症患者组(70.37%VS 19.05%,;P0.001)。然而,在相对低SEMG1 mRNA表达组(75.00%VS 20.83%,P0.001)和相对高miR-525-3p表达组(66.67%VS 29.16%,p0.001)中观察到较高的生育率。结论:1.弱精症患者精液精子中miR-525-3p表达水平降低而其靶基因SEMG1表达水平升高,并且与精子活力及形态密切相关。2.精子中miR-525-3p/SEMG1的表达水平与弱精症所致的男性不育的发生密切相关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R698.2

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