CM-DIL标记新西兰兔骨髓间充质干细胞联合膀胱脱细胞基质修复膀胱的动物实验

发布时间：2020-08-28 21:41

　　 目的:(1)CM-DIL标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,观察标记前骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质(BAMG)共同培养后的生存情况,以确保移植到实验动物体内的种子细胞的存活效果。(2)骨髓间充质干细胞是否在体内存活并发生迁移,是否参与了膀胱组织缺损的重建。(3)评估不同的种子细胞移植途径对缺损膀胱组织修复效果的影响。(4)观察各组修复膀胱组织IL-2及IL-4的表达。方法:分离培养得到新西兰兔骨髓间充质干细胞,制备兔膀胱脱细胞基质,收集培养得到的p3代骨髓间充质干细胞进行流式细胞学检测,用CM-DIL标记BMSCs。将实验兔分为以下四组:静脉注射BMSCs联合BAMG修复膀胱组、局部注射BMSCs联合BAMG修复膀胱组、单纯BAMG修复膀胱组、切除相同面积膀胱壁后直接缝合组,膀胱缺损模型成功建立并养殖七周后处死动物将膀胱取出,对各组膀胱修复部位取材并将其分为两部分,一部分通过冰冻切片观察染色的BMSCs显色情况及组织结构,并通过免疫组化观察重建膀胱组织尿路上皮(AE1/AE3单抗)、平滑肌(α-SMA单抗)和血管(CD31单抗)的表达情况以此衡量新生膀胱的修复效果,另一部分用于RT-qPCR检测抗炎因子IL-4及促炎因子IL-2的表达变化。结果:(1)CM-DIL在体外成功标记兔骨髓间充质干细胞,标记浓度选为4mg/L时荧光标记率为93.7%,同时CCK-8法显示此浓度对细胞活性未产生明显影响。(2)注射标记CM-DIL的BMSCs的两组动物在7周后能在修复膀胱组织中找到显色BMSCs,且显色效果皆满意,而且局部注射BMSCs组修复组织中显色细胞数明显多于静脉注射组(p0.05)。(3)HE染色结果回报:单纯修补BAMG组的膀胱结构尚可见,但平滑肌组织排列纷乱、血管及神经稀少。局部注射BMSCs组与静脉注射BMSCs组内膀胱三层结构已形成,外膜内可见神经、血管和平滑肌组织。重新修复的膀胱组织的尿路上皮(AE1/AE3单抗)、平滑肌(α-SMA单抗)和血管(CD31单抗)都有良好的表达,且通过半定量分析测定的三项指标的IOD值(阳性表达面积)皆为局部注射BMSCs组静脉注射BMSCs组单纯修补BAMG组(p0.05)。(4)术后第七周膀胱组织内IL-2及IL-4各组浓度皆为单纯修补BAMG组静脉注射BMSCs组局部注射BMSCs组(p0.05)。结论:(1)利用CM-DIL作为BMSCs的示踪剂是可行的,它可以在不伤害细胞活性的同时给种子细胞提供稳定的荧光表达。(2)静脉注射的CM-DIL-BMSCs在实验兔体内发生了归巢,和静脉注射组相比组织局部注射的CM-DIL-BMSCs定植于受损组织内的数目更多。(3)和单纯BAMG修复膀胱相比局部注射BMSCs组与静脉注射BMSCs组的实验兔组织工程膀胱结构接近正常兔膀胱结构,有较为丰富的尿路上皮、平滑肌及血管组织。(4)移植兔BMSCs可降低膀胱组织内IL-2及IL-4水平,促进受损部位的修复。
【学位单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R699
【部分图文】：

1 显微镜下 BMSCs 的形态 显微镜下的第一代 BMSCs（×100） B 显微镜下的第三代 BMSCs（×100）1A 为第一代兔骨髓间充质干细胞，混杂有少量杂质细胞；图 1B 为第三代兔骨髓间充质的三角形，梭形，鱼肉状。 兔骨髓间充质干细胞表面标志流式鉴定

图 2 BMSCs 的表面标志物表达-D 为兔 BMSCs 流式细胞学检测结果显示：表达 CD-29 和 CD-44 而不表达 CD-45、CA-DR-A。膀胱脱细胞基质制备及复合物的形态观察经过上述制备脱细胞基质的步骤可制得一半透明组织，该组织呈浅白色，可

图 3A. 扫描电镜下的 BAMG（×1000） 图3B. HE 染色后的支架种子细胞复合物(×13.4 显微镜下 CM-DIL 标记后的兔骨髓间充质干细胞的形态通过调制成特定浓度后的 CM-DIL 溶液标记兔骨髓间充质干细胞，标记 24h 后胞在荧光显微镜下可观察到明显的红色（见图 4A 及图 4B）。

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本文编号：2808206