京尼平交联法改善大鼠肾支架的生物学性能

发布时间：2020-09-17 15:09

　　 【目的】单纯的去细胞生物支架存在脆性增强、成形能力差、易降解等不足,往往需要经过交联反应改善支架的各项生物性能,本研究的主要目的是通过浸泡交联法制备京尼平交联改性去细胞全肾支架,以改善去细胞肾支架的降解时间、抗炎及生物力学性能,为临床需要奠定基础。【方法】健康SD大鼠80只,体重为250g左右,随机分为正常组、未交联支架组、戊二醛交联支架组和京尼平交联支架组。游离大鼠肾脏、肾动静脉,连接蠕动泵,将大鼠肾脏经PBS灌注去血以后得到的肾脏作为正常组。大鼠肾脏被依次灌入肝素化PBS溶液、1%Triton X-100、1%十二烷基硫酸钠(SDS)、去离子水,以完成大鼠肾脏去细胞生物支架制备。戊二醛交联支架组继续灌入0.625%戊二醛(GA)溶液1500ml,灌注时间为12小时;京尼平交联支架组浸入到0.5%的京尼平溶液中37℃恒温箱中行化学交联24h;未经戊二醛和京尼平交联的肾脏去细胞支架作为未交联支架组。对四组肾脏分别作HE、Masson、免疫荧光染色镜检及电子显微镜扫描,观察支架组织形态学及超微结构改变;力学拉伸试验检测并对比各组机械力学性能;皮下包埋实验检测各组支架的抗炎性及抗降解能力;细胞支架共培养实验检测不同交联剂对细胞生长与增殖的影响。【结果】SD大鼠肾脏支架经京尼平交联后,HE、Masson染色显示胶原纤维排列更加紧密有序,肾小球处的纤维聚集,并且胶原蛋白I和胶原蛋白IV荧光染色得到增强,电镜扫描显示,交联后的去细胞支架的纤维连续无断裂,三维空间结构呈蜂窝状排列,典型的肾小球结构轮廓更加清晰;机械性能测试显示交联组肾弹性模量较未交联支架组明显增强。皮下包埋实验表明在移植术后3天和7天时,炎性细胞的数量在京尼平交联组显著低于未交联组,并且支架的肾小球轮廓在14天时仍然清晰可见,未被降解,未交联支架组以及正常组肾组织中进一步被炎性细胞浸润,发生了降解,并与宿主组织界限模糊不清。细胞支架共培养实验表明,各组内的血管内皮细胞都能粘附于支架的表面生长,和京尼平交联后,肾支架与血管内皮细胞的细胞相容性良好。【结论】京尼平交联大鼠肾支架的交联方法简单易行,并且具有良好的抗炎、抗降解性及生物相容性,使肾脏去细胞支架的三维空间结构更为饱满立体,大大提高了支架的生物学性能,能更好地为后期细胞植入和器官再生奠定基础。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.08;R692.5
【部分图文】：

3.1 大体形态观测及组织学和免疫组织化学鉴定正常对照组大鼠的肾脏为暗红色，经过去细胞溶液灌注去细胞后，肾脏颜色由暗红色变为土黄色，最终变为白色半透明。肾内树状脉管分支结构清晰可见，并且保持原有的肾形而略塌陷。经戊二醛交联后的肾支架变为淡黄色，经京尼平交联后的肾支架变为降蓝色（图 1）。HE 染色显示正常组肾切片内可见蓝色的细胞核以及红色的细胞质，未交联支架组、戊二醛交联支架组以及京尼平交联支架组肾切片内均未见蓝色的细胞核，肾小球轮廓仍然存在（图 2），表明去细胞后SD 大鼠肾组织细胞核成分被去除。Masson 染色结果显示（图 2），正常组的肾切片内可以清楚的看到肾小球和肾小管的形态。胶原纤维呈浅蓝色和交织成没有明显的裂缝的网络状结构。经京尼平交联后的肾小球轮廓明显比戊二醛组以及未交联组清晰，这表明通过京尼平交联后肾支架中的胶原纤维更加密集。

图 2 SD 大鼠肾脏各组 HE 与 Masson 染色,黑色箭头所指为肾小球Fig.2 HE staining of all the groups of SD rat kidney, the blank arrows pointingglomerulus3.2 免疫荧光结合 DAPI 染色肾脏细胞外基质主要成分包括一型胶原和四型胶原，一般情况下一型胶原聚集为胶原纤维，交织排列成网，构成细胞外基质框架；四型胶原主要分布在肾小球和肾小管基底膜以及肾小球系膜区，主要参与构成肾小球滤过屏障[26]。免疫组织荧光染色显示 SD 大鼠正常组红染的一型胶原、绿染的四型胶原以及蓝染的细胞核，而各支架组仅显示红染的一型胶原、绿染的四型胶原，无蓝染细胞核成分（图 3），经京尼平交联的肾去细胞生物支架荧光染色增强，荧光显示肾小球的轮廓清晰可见，胶原纤维呈网状分布，表明去细胞处理后肾支架内的细胞核成分

图 3 SD 大鼠肾脏各组 Collagen I、Collagen IV 以及 DAPI 免疫荧光染色，白色箭头所指为肾小球Fig.3 Immunofluorescence staining of Collagen I、Collagen IV and DAPI in allthe groups of SD rat kidney, the white arrows pointing glomerulus3.3 扫描电镜检测电镜扫描显示在肾去细胞生物支架未交联组、戊二醛交联组和京尼平交联组的肾去细胞生物支架上均没有细胞残留物，并且胶原完全连接而没有破裂。镜下可见 SD 大鼠肾脏支架支架内部结构为蜂窝状结构，清晰地呈现出胶原纤维排列形成的三维立体空间结构以及明显的肾小球龛样轮廓结构（剖面，图 4），经京尼平交联后的肾小球处的空间结构更为立体，说明交联的过程并没有破坏胶原纤维排列形成的三维空间结构，交联后的胶原纤维形成的空间构架更为饱满立体。

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本文编号：2820879