Wnt7a通过激活经典Wnt通路促进膀胱癌细胞侵袭

发布时间：2020-09-23 09:59

　　 膀胱癌(UBC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,在美国男性癌症相关死亡率中排名第八,2017年男性预计死亡人数为12240人。低级别非肌肉侵袭性肿瘤占新诊断膀胱癌病例的75%,其中15-20%的患者会进展为肌肉侵袭性膀胱癌(MIBCS;≥T2期)。然而,肌肉侵袭性膀胱癌会发生转移,患者预后5年生存率50%。因此,研究膀胱癌病人侵袭和转移的原因是具有重要意义的。Wnt家族由19种分泌的糖蛋白组成,在调节细胞增殖、细胞分化和细胞命运等过程中发挥重要作用。Wnt与Frizzleds(Fzds)的七个跨膜蛋白家族成员及其相关的共受体结合,刺激下游复杂的网络,这些网络依赖于β-catenin(经典通路),或者不依赖于β-catenin(非经典通路)。尽管在各种癌症中检测到Wnt信号通路的频繁突变,但是除了关于Wnt相关基因的单核苷酸多态性与膀胱癌风险的关联报道之外,在膀胱癌中Wnt信号通路的体细胞突变还鲜少报道。之前有报道称,在小鼠尿路上皮细胞中,Wnt和AKT途径同时激活,协同导致了膀胱癌的形成,这表明Wnt通路在膀胱癌发生过程中发挥了重要作用。不过目前尚不清楚Wnt通路中哪些成分可能在膀胱癌侵袭和转移中起关键作用。在本文的研究中,我们使用人膀胧癌5637细胞株,从中筛选出了具有低侵袭能力(5637NMI)和高侵袭能力(5637HMI)的两株细胞。质谱分析显示,Wnt7a在高侵袭能力(5637 HMI)细胞中的表达高于低侵袭能力(5637NMI)细胞。同时我们还发现,Wnt7a表达升高与膀胱癌转移和膀胱癌患者的不良预后相关。于是,我们在5637 HMI和T24细胞中敲降了 Wnt7a,结果显示在细胞中敲降Wnt7a降低了膀胱癌细胞的侵袭和β-catenin表达水平,并降低了参与上皮间充质转化(EMT)和细胞外基质(ECM)降解的下游靶基因水平。随后我们用Wnt7a重组蛋白处理5637NMI和J82膀胱癌细胞株后,提高了细胞侵袭、上皮间充质转化和细胞外基质降解相关基因的表达。TOP/FOPflash荧光素酶实验分析表明,Wnt7a激活了膀胱癌细胞中经典的β-catenin信号通路,且Wnt7a表达量增加与UBC样本中的β-catenin核信号增加有关。除此之外,我们发现敲降Wnt7a抑制基质金属蛋白酶10(MMP10)的表达,Wnt7a过表达通过TCF/LEF两个启动子位点激活MMP10启动子活性,这两种现象证实Wnt7a通过经典的Wnt/β-catenin途径介导MMP10激活。最后,我们在临床样本中证实,相比与癌旁正常组织,膀胱癌组织中Wnt7a的mRNA和蛋白水平都显著升高,并且TCGA数据库数据显示,Wnt7a表达量高的膀胱癌患者总生存率显著低于Wnt7a表达量低的患者。我们证实在侵袭阶段早期,尿路上皮切片中细胞质的Wnt7a染色较弱,β-catenin膜信号染色较强,而在侵袭性膀胱癌切片中细胞质的Wnt7a染色较强,β-catenin核信号染色较强,这说明在膀胱癌样本中Wnt7a过表达与Wnt/β-catenin信号通路激活是有相关性的。此外,与正常组织相比,膀胱癌组织中MMP10的mRNA水平显著升高,并且MMP10也与Wnt7a的的mRNA水平呈正相关。综上所述,我们的实验结果确立了一条通过经典的Wnt/β-catenin信号控制UBC侵袭的轴,这可能会给临床患者的治疗和预后提供参考。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.14
【部分图文】：

。杂，种类众多，常见的有Ｗｎｔ／ＪＮＫ通路、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋通路等。对于号通路的研究，近年来开始逐渐增多。Ｗｎｔ／ＪＮＫ通路又称平面细ａｒ－ｃｅｌｌ邋ｐｏｌａｒｉｔｙ，ＰＣＰ）途径，它是由邋Ｆｒｉｚｚｌｅｄ邋（Ｆｚｄ）激活，与经典路在Ｄｓｈ阶段分支，通过Ｄｓｈ连接下游的效应分子，包括ＧＴＰ酶ｏ相关激酶（Ｒｈｏ邋ａｎｄ邋Ｒｈｏ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅ，ＲＯＣＫ）。该通路参与了不架重排和ｃ－ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ－ＪｕｎＮ－ｔｅｎｎｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）以胞板上细胞的极性作用，可以阶段性调控胚胎发育［１８］。在Ｗｎｔ／Ｃａ２＋ｎｔ信号引起了细胞内Ｃａ２＋水平增加，再通过钙依赖性激酶、钙调子ＮＦ－ＡＴ发挥生理效应，并且该途径还可以抑制Ｗｎｔ／（３－ｃａｔｅｎｉｎ通卩－ｃａｔｅｎｉｎ的表达降低｜７１。Ｃａ２＋敏感信号也可激活蛋白激酶Ｃ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ｃ，邋ＰＫＣ），邋ＰＫＣ作用于细胞核中的转录因子，同时也能激活细胞质与生化反应，进而通过参与基因表达调控而影响细胞的生长和分化ＰＰＯＲＣＮ邋ＭＭｂＭｏｒ逡逑

为了探讨ＵＢＣ细胞侵袭的机制，我们通过反复Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ筛选，从５６３７邋ＵＢＣ逡逑细胞系中分离出了具有低侵袭能力（５６３７邋ＮＭＩ）和高侵袭能力（５６３７邋ＨＭＩ）的逡逑两株细胞。如图２．１Ａ所示，５６３７细胞未能或成功侵入Ｍａｔｒｉｇｅｌ包被的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ逡逑Ａ逦Ｃ逡逑ＮＭＩ逦ｔｕｐＭｔ逦ＮＭＩ逦逦邋逦６ｔ３７逦逦邋逦逡逑（ＰＩ）逦ＣｏＩＩｋｉｍｍ逦（ｆ？１２）逦＿逦ＷＨＪ逦ｐｆＸｌＷＣＨＴ逦ＨＭＩ邋＿逡逑Ｗ７ＮＭＩ邋ｃｎ％邋？邋８Ｍ７邋ＨＭＩ邋ｃ？ｌｈ邋Ｏ邋ｍ0ｆｗ＾ｄｆ？ｅ？ｙ邋＞？ｖｓ＊ｖ邋Ｓ６Ｉ７邋＜？ｌｈ￣｜逡逑ＮＭＩ逦ｐａｒｅｎｔａｌ邋ｅｖｉｌｓ逦ＨＭＩ逦＿逡逑＿姦１１１＿＿逡逑＊°＊１逦…逦１２0１邋￣￣５６３７邋ＮＭＩ逦…逡逑１逦￣￣逦５－１００－邋。》Ｊ７邋ｐ＊ｒ？？ＵＩ逦＿１＾＿逡逑Ｉ邋？00逦逦Ｃ逦５Ｍ７邋ＭＭ？逡逑＼逦ｒ＾ｉ逦ｉｓ邋￣逦．．．逦—逡逑ｉ邋４００逦－逦｜！邋？■邋￣２Ｚ逦ｒｉ逡逑］？0逦ｉｆｗ．二门逡逑＇Ｊｒ＾ｒｎ邋Ｐ＾￣ｌ邋Ｌ—１．

膀胱癌转移分子机制研宄逡逑ＵＢＣ中的作用仍不清楚［１５（）１，因此我们首先分析了其在ＵＢＣ样本中的表达水平。逡逑如图２．３Ａ所示，与癌旁正常组织相比，ＵＢＣ样本（ｎ＝４１）的ｗｎｔ７ａｍＲＮＡ水平逡逑平均增加了邋２．０８倍。我们进一步发现，与癌旁正常组织相比，ＵＢＣ组织中的逡逑Ｗｎｔ７ａ蛋白水平显著增加（ｎ＝２０，邋ｐ＝０．０３３９；图２．３Ｂ和２．３Ｃ）。使用来自公共数逡逑据集（ＴＣＧＡ，临时）的独立数据，无淋巴结转移性病变（Ｎ０）的ＵＢＣ的Ｗｎｔ７ａ逡逑ｍＲＮＡ水平比正常膀胱组织高７．２倍，而有淋巴结转移性病变（２Ｎ１）的ＵＢＣ逡逑甚至比无淋巴结转移性病变的ＵＢＣ高１．６２倍（ｐ＜０．０５；图２．３Ｄ）。而且，与正逡逑常膀胱组织相比，无远处转移灶（Ｍ０）的ＵＢＣ中Ｗｎｔ７ａ的ｍＲＮＡ水平高出７．５８逡逑倍。有远处转移灶（Ｍｌ）的ＵＢＣ比无远处转移灶（Ｍ０）的ＵＢＣ高２．４４倍（ｐ＜０．０５；逡逑图２．３Ｅ）。值得注意的是，在ＴＣＧＡ数据库的两列中，Ｗｎｔ７ａｍＲＮＡ水平高的逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑°１邋ｐ－０．０１３１逦１２逦３逦４逦Ｓ逦？逦７逦？逦？逦１０逡逑ＩＮＴＮＴ邋ＷＴ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｗ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｈ邋Ｊ邋￣Ｈ￣Ｊ邋Ｎ邋Ｔ逦１Ｓ逦ｐ－０．０３３９逡逑Ｗｎｔ７———邋一逦｜逦

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