各种原因导致的慢性肾脏疾病(CKD)已成为严重危害人类健康的公共卫生问题,急性肾损伤(AKI)加速CKD的发展,而CKD病人则更容易发生AKI。缺血性再灌注(I/R)损伤是AKI的主要病因之一。上皮间质转化(EMT)是在肾间质纤维化发生发展中起着重要作用,其表现为上皮标志物如E-钙粘蛋白(E-cadherin)丧失及间质标志物如α-平滑肌动蛋白(α-SMA)增多。持续且严重的损伤刺激下,去分化的肾小管上皮细胞会释放促纤维化细胞因子,使成纤维细胞及管周细胞等转化成具有瘢痕形成能力的肌成纤维细胞,导致细胞外基质(ECM)沉积,如纤连蛋白(Fibronectin,FN)及I型胶原(collagenl)。在众多促纤维化细胞因子中,转化生长因子beta(TGF-β)被认为起着主导作用,其与其下游激活的Smad通路被认为在肾间质纤维化发生发展中起着关键作用。Tisp40属于CREB/CREM家族转录因子,与细胞凋亡和增殖相关。我们最近研究肾脏I/R损伤中发现,Tisp40在I/R后显著升高。因此我们推测Tisp40与肾间质纤维化之间存在密切关系,并可能参与肾间质纤维化的发生与发展。在本研究中,我们通过体内外实验探讨Tisp40在I/R诱导的肾间质纤维化及TGF-β1诱导的肾细胞纤维化的表达变化、作用及具体机制。我们的研究结果表明:无论I/R诱导的纤维化动物模型还是TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中,Tisp40表达均明显上调。我们还发现Tisp40可调节Smad2及Smad3磷酸化过程通过TGF-β/Smad信号通路诱导EMT及ECM沉积,包括促进α-SMA、FN及collagen I的表达,抑制E-cadherin的表达。此外,我们的研究还发现在没有TGF-β1刺激时,Tisp40并不能参与调节Smad2及Smad3磷酸化过程。综上:我们的研究结果表明Tisp40在肾间质纤维化中表达上调,下调Tisp40能减少Smad2及Smad3磷酸化,减弱TGF-β/Smad信号通路而抑制EMT及ECM沉积,减轻肾间质纤维化。第一部分Tisp40与肾间质纤维化的关系目的:探讨Tisp40在缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)诱导的肾间质纤维化及转化生长因子 betal(Transforming growth factor betal,TGF-β1)诱导的小鼠肾小管上皮细胞系TCMK-1中表达量的变化,验证所构建的慢病毒转染Tisp40过表达细胞系TCMK-1/Tisp40效果并在3种所构建的siRNA-Tisp40中筛选沉默效果最好的siRNA-Tisp40。方法:体内实验C57BL/6小鼠I/R建立肾脏纤维化动物模型,免疫组化、RT-PCR及Western blot检测各组小鼠肾脏Tisp40的分布与表达。体外实验采用TGF-β1(10ng/ml)刺激TCMK-1细胞24h建立肾细胞纤维化模型,Western blot检测TGF-β1不同浓度(0.1,1,10ng/ml)及刺激时间(4,8,12,24,48h)下 Tisp40蛋白的表达变化。在野生型TCMK-1细胞(TCMK-1/wildtype,TCMK-1/wt)及Tisp40 过表达的 TCMK-1/Tisp40 细胞中,RT-PCR 及 Western blot 检测 Tisp40 mRNA及蛋白表达变化,免疫荧光评估所构建的TCMK-1/Tisp40细胞效果。Western blot检测Tisp40被沉默后的蛋白表达,比较三种siRNA-Tisp40(siRNAl-Tisp40,siRNA2-Tisp40,siRNA3-Tisp40)沉默效率。结果:体内实验假手术组小鼠(Sham)肾脏Tisp40表达较少;缺血再灌注纤维化组(I/R)中小鼠肾脏Tisp40mRNA及蛋白表达明显增加(p0.05),Tisp40蛋白主要表达于肾小管。体外实验Tisp40随TGF-β1浓度(0.1,1,10ng/ml)及刺激时间(4,8,12,24,48h)改变,表达逐渐增多,存在浓度及时间依赖性,在lOng/mlTGF-βi刺激24h后Tisp40表达基本稳定;TCMK-1/wt细胞在TGF-β1刺激前,仅少量表达Tisp40,TCMK-1/wt细胞及TCMK-1/Tisp40细胞经TGF-β1刺激24h后,Tisp40mRNA及蛋白表达明显增多(p0.05),在TGF-β1刺激前后,TCMK-1/Tisp40细胞的Tisp40表达均高于TCMK-1/wt细胞(p0.05),Tisp40 过表达细胞系 TCMK-1/Tisp40 构建成功。3 种 siRNA-Tisp40 均可沉默Tisp40,siRNA3-Tisp40沉默效率最高。结论:在I/R诱导的肾间质纤维化及TGF-β1诱导的肾细胞纤维化中,Tisp40表达均明显上调,提示Tisp40与肾间质纤维化之间存在密切关系。第二部分Tisp40在肾间质纤维化中的作用目的:探讨Tisp40对I/R诱导的肾间质纤维化及TGF-β1诱导的肾细胞纤维化中的作用。方法:体内实验野生型(Tisp40+/+)及Tisp40基因敲除(Tisp40-/-)C57BL/6小鼠I/R建立肾脏纤维化动物模型,Masson染色及羟脯氨酸测定评估各组小鼠肾间质纤维化程度,RT-PCR及Western blot检测各组小鼠肾脏Tisp40的mRNA及蛋白表达,免疫组化、RT-PCR及Western blot检测各组小鼠肾脏α-平滑肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、纤连蛋白(fibronectin,FN)及Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)的mRNA及蛋白表达。体外实验 RT-PCR 及 Western blot 检测 TCMK-1/wt 细胞、Tisp40 过表达TCMK-1/Tisp40 细胞及空载组(TCMK-1/vector)在 10ng/ml TGF-β1刺激 24h 前后α-SMA、E-cadherin、fibronectin 及 collagen Ⅰ mRNA 及蛋白表达,免疫荧光检测fibronectin蛋白表达。我们还使用Lipofectamine RNA iMAX将具有最高沉默效率的siRNA3-Tisp40转染至TCMK-1细胞,转染后48h,l0ng/ml TGF-β刺激24h,RT-PCR 及 Western blot 检测 TGF-β1刺激前后 α-SMA、E-cadherin、fibronectin及collagen Ⅰ的mRNA及蛋白表达,免疫荧光检测fibronectin蛋白表达。结果:体内实验I/R前,Tisp40+/+及Tisp40-/-小鼠肾脏的Tisp40 mRNA及蛋白表达均很低,I/R后,Tisp40+/+小鼠肾脏的Tisp40mRNA及蛋白表达明显增高(p0.05),而Tisp40-/-小鼠肾脏的Tisp40mRNA及蛋白的表达水平仍很低,表明Tisp40敲除成功。I/R后,与Tisp40+/+小鼠相比,Tisp40-/-小鼠肾脏中α-SMA、fibronectin 及 collagen Ⅰ 的 mRNA 及蛋白表达明显下降(p0.05),而 E-cadherin的mRNA及蛋白表达明显上升(p0.05)。体外实验与TCMK-1/wt和TCMK-1/vector 细胞相比,TCMK-1/Tisp40 细胞在 TGF-β1刺激后,α-SMA、fibronectin 及 collagen Ⅰ 的 mRNA 及蛋白表达明显升高(p0.05),而 E-cadherin的mRNA及蛋白表达明显下降(p0.05),但在没有TGF-β1刺激的情况下,高表达的 Tisp40 对α-SMA、E-cadherin、fibronectin 及 collagen Ⅰ 的表达没有影响。与之类似,siRNA-Tisp40虽然可有效沉默Tisp40表达,但在没有TGF-β1刺激的情况下,并不影响α-SMA、E-cadherin、fibronectin 及 collagen Ⅰ mRNA 及蛋白表达,在TGF-β1刺激后,沉默组(siRNA-Tisp40)较对照组(Scramble),α-SMA、fibronectin及 collagen Ⅰ mRNA 及蛋白表达明显下降(p0.05),而E-cadherin的mRNA及蛋白表达明显升高(p0.05)。结论:下调Tisp40可通过抑制上皮间质转化(EMT)及细胞外基质(ECM)沉积减轻肾间质纤维化,上调Tisp40有相反作用。我们的研究结果表明,Tisp40在肾间质纤维化中发挥重要作用,阻断Tisp40能通过抑制EMT及ECM沉积过程保护肾脏。第三部分Tisp40调节肾间质纤维化的信号机制目的:探讨Tisp40对TGF-β/Smad及Snail信号通路的调节作用,明确Tisp40调节I/R诱导的肾间质纤维化及TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化的具体信号机制。方法:体内实验C57BL/6小鼠I/R建立肾脏纤维化动物模型,Western blot检测小鼠肾脏Smad2、Smad3及pSmad2/3蛋白表达,评估I/R诱导纤维化后,TGF-β/Smad信号通路活化情况。Tisp40+/+及Tisp40-/-C57BL/6小鼠I/R建立肾脏纤维化动物模型,RT-PCR及Western blot检测小鼠肾脏TGF-β的mRNA及蛋白表达,Western blot检测小鼠肾脏Smad2及Smad3蛋白表达,免疫组化及Western blot检测小鼠肾脏pSmad2/3及Snail蛋白表达。体外实验Western blot检测 TCMK-1/wt 细胞、TCMK-1/Tisp40 细胞及 TCMK-1/vector 细胞在 10ng/ml TGF-βi刺激1h前后Smad2、Smad3、pSmad2/3及Snail蛋白表达。我们还使用Lipofectamine RNA iMAX将具有最高沉默效率的siRNA3-Tisp40转染至TCMK-1 细胞,转染后 48h,10ng/ml TGF-β刺激 1h,Western blot 检测 TGF-β1刺激前后Smad2、Smad3、pSmad2/3及Snail蛋白表达。结果:体内实验I/R损伤能够活化TGF-β/Smad信号通路。I/R前,Tisp40+/+及Tisp40-/-小鼠肾脏的 TGF-β、Smad2、Smad3、pSmad2/3 及 Snail 蛋白表达水平较低,I/R 后,Tisp40+/+及 Tisp40-/-C57BL/6 小鼠肾脏的 TGF-β、Smad2、Smad3、pSmad2/3 及 Snail 均上调(p0.05),与 Tisp40+/+小鼠相比,Tisp40-/-小鼠 TGF-β、Smad2及Smad3蛋白表达差异无统计学意义(p0.05),而pSmad2/3与Snail蛋白表达明显降低(p0.05)。体外实验TGF-β1刺激前,在TCMK-1/wt、TCMK-1/Tisp40 及 TCMK-1/vector 三种细胞中,Smad2、Smad3、pSmad2/3 及Snail蛋白表达水平较低,TGF-β1刺激后,三种细胞中的Smad2、Smad3、pSmad2/3及 Snail 均上调(p0.05)。与 TCMK-1/wt 和 TCMK-1/vector细胞相比,TCMK-1/Tisp40细胞的Smad2及Smad3蛋白表达差异无统计学意义(p0.05),而pSmad2/3与Snail蛋白表达明显增高(p0.05)。在没有TGF-β1刺激时,高表达的Tisp40对Smad2、Smad3、pSmad2/3及Snail蛋白表达没有影响,这可能因为没有足够量的TGF-β1激活纤维化过程。与之类似,siRNA-Tisp40虽然可有效沉默Tisp40表达,但在没有TGF-β刺激时,Tisp40并不影响Smad2、Smad3、pSmad2/3 及 Snail 蛋白表达,在 TGF-β1刺激后,siRNA-Tisp40 组较 Scramble组,Smad2及Smad3蛋白表达差异无统计学意义(p0.05),而pSmad2/3与Snail蛋白表达明显降低(p0.05)。结论:Tisp40可调节Smad2及Smad3磷酸化,通过TGF-β/Smad信号通路,参与纤维化过程。下调Tisp40能减少Smad2及Smad3磷酸化,减弱TGF-β/Smad信号通路,保护纤维化肾脏。这为临床治疗肾间质纤维化提供新的治疗靶点。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：
图１缺血再灌注诱导的肾纤维化中，ＴｉｓＰ４０的表达和分布逡逑Ａ．各组小鼠肾组织Ｔｉｓｐ４０的分布（免疫组化，ｘ４00）逡逑Ｂ．各组小鼠肾组织Ｔｉｓｐ４０的表达（左：ＰＴ－ＰＣＲ，右：Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ）逡逑注：＊ｐ＜０．０５，与Ｓｈａｍ组比较。逡逑
图２各组细胞中Ｔｉｓｐ４０的表达（左：ＰＴ－ＰＣＲ，右：Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ）逡逑注：＊＊ｐ＜０．０１，与邋ＣＯＮ邋组邋ＴＣＭＫ－１／ｗｔ邋细胞比较；＃＃ｐ＜０．０１，与邋ＴＧＦ－３邋组逡逑ＴＣＭＫ－１／ｗｔ细胞比较。逡逑３．邋Ｔｉｓｐ４０对ＴＧＦ－Ｊ３刺激的浓度及时间依赖性逡逑
３．邋Ｔｉｓｐ４０对ＴＧＦ－Ｊ３刺激的浓度及时间依赖性逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ邋结果显示，Ｔｉｓｐ４０邋随邋ＴＧＦ－（３ｉ邋浓度（０．１，１，１０ｎｇ／ｍｌ）增加，逡逑表达逐渐增多，存在浓度依赖性，见图３Ａ；邋Ｔｉｓｐ４０随丁０？－卩１刺激时间（４，邋８，逡逑１２，２４，邋４８ｈ）改变，表达逐渐增多，存在时间依赖性，在１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－ｐ刺激逡逑２４ｈ后Ｔｉｓｐ４０表达基本稳定，见图３Ｂ。逡逑Ａ逡逑ＴＧＦ－（３邋（ｎｇ／ｍｌ）逡逑ｃｏｎ邋０．１逦１逦１０逡逑Ｔｉｓｐ４０逦一逡逑（３－ａｃｔｉｎ逡逑ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ逡逑Ｂ逡逑ＴＧＦ－Ｐ邋（ｌＯｎｇ／ｍｌ）逡逑ｃｏｎ邋４逦８￣１２￣２４￣４８＊逡逑丁ｉｓｐ４０逦？邋？邋—逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逦灥？逡逑图３邋Ｔｉｓｐ４０对ＴＧＦ－ｐ刺激的浓度及时间依赖性逡逑Ａ．逦Ｔｉｓｐ４０对ＴＧＦ－Ｐ浓度刺激浓度依赖性（０．１，１，１０ｎｇ／ｍｌ）逡逑Ｂ．逦Ｔｉｓｐ４０对ＴＧＦ－Ｐ浓度刺激时间依赖性（４，８，１２，２４，４８ｈ）逡逑２２逡逑
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