大鼠肾脏内草酸转运体Slc26a6的表达对实验性草酸钙结石形成的作用研究

发布时间：2020-09-26 16:19

　　第一部分大鼠肾脏内不同的Slc26a6表达引起形成草酸钙结晶的差异研究目的:溶质相关载体26基因家族6号蛋白(Solute-linked carrier 26 gene family 6,Slc26a6)主要在肠道和肾脏中表达,它是一种在草酸阴离子转运中至关重要的多功能阴离子转运蛋白。本部分研究旨在探讨肾脏内不同Slc26a6蛋白的表达对肾脏在高草酸环境下产生结晶数量的影响。方法:在临床上收集由于高草酸尿引起的草酸钙结石患者的切除肾脏标本作为结石组,收集肾脏肿瘤或者肾脏结核患者的切除肾脏标本作为对照组。通过Western blot和免疫组织化学的方式对两组肾脏的Slc26a6蛋白表达水平进行比较。分别构建带有Slc26a6基因序列的慢病毒(Lentivirus-Slc26a6)和带有干扰Slc26a6表达功能的siRNA-Slc26a6序列的慢病毒(Lentivirus-siRNA-Slc26a6)将构建完成的病毒通过肾包膜下注射的方式稳定感染至大鼠肾脏内。通过Westernblot和免疫组织化学的方式对大鼠肾脏和肠道Slc26a6表达情况进行鉴定。随后,通过饲喂乙二醇的方式,构建高草酸尿大鼠模型。经过乙二醇饲喂一个月后,检测大鼠的高草酸尿情况和肾脏内结晶形成数量差异。结果:免疫组织化学和Western blot分析表明,与对照组相比,结石形成者在肾脏中具有显著更高的Slc26a6表达水平。慢病毒感染后,慢病毒-Slc26a6感染大鼠的尿草酸浓度和结石形成率显著增加,而慢病毒-siRNA-Slc26a6感染的大鼠晶体较少。结论:结果显示,肾脏内Slc6a6的高表达水平可能是促成肾结石形成的原因之一。下调Slc26a6在肾脏中的表达可能是预防或治疗肾结石的潜在治疗靶点。第二部分Slc26a6蛋白表达对大鼠肾小管上皮细胞功能的影响目的:本部分旨在研究肾小管上皮细胞内Slc26a6表达差异对草酸盐诱导的细胞氧化和晶体形成的影响。方法:分别构建带有Slc26a6基因序列的慢病毒(Lentivirus-Slc26a6)和带有干扰Slc26a6表达功能的siRNA-Slc26a6序列的慢病毒(Lentivirus-siRNA-Slc26a6)通过慢病毒稳定感染肾小管上皮细胞(NRK-52E)以上调或下调细胞中Slc26a6的表达。通过qPCR、Western blot和免疫荧光的方法对细胞内Slc26a6蛋白表达进行测定。通过CCK8方法检测细胞活力,Annexin V/PI流式细胞学检测细胞凋亡情况,DCFH-DA流式细胞学测量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。检测丙二醛(Malonaldehyde,MDA)生成。使用光学显微镜观察晶体粘附情况,并通过透射电子显微镜观察细胞的超微结构。随后利用Lentivirus-siRNA-Slc26a6感染SD大鼠肾脏,通过1.0%乙二醇和0.5%氯化铵饲喂2周后,分别测量不同组内大鼠肾脏的超氧化物产生情况、细胞凋亡情况以及肾脏内结晶产生情况。结果:在体外研究中,与对照组相比,上调Slc26a6表达的NRK-52E细胞在高草酸盐环境下细胞活力降低更显著,细胞凋亡率显著增加,ROS产生增加,MDA产生增加。下调Slc26a6表达的NRK-52E细胞在暴露高草酸盐环境后的晶体粘附和细胞内囊泡明显少于未感染的对照组。体内研究中,感染Lentivirus-siRNA-Slc26a6的大鼠在肾中表现出活性氧生成量、细胞凋亡和晶体形成均减少。同时NFκB磷酸化增强和OPN的磷酸化增加在病理过程中都起到重要作用。结论:本部分的研究结果表明,降低肾脏中Slc26a6的表达可能是预防结石形成的潜在策略。第三部分实验性高草酸尿大鼠肾脏microRNA的表达变化目的:全面了解实验性高草酸尿大鼠形成结石过程中大鼠肾脏miRNA的表达变化。方法:采用高通量micro-RNA生物芯片技术,寻找在高草酸尿结石形成SD大鼠与正常SD大鼠肾脏内miRNA表达谱的差异。通过miRNA数据库,预测miRNA的靶基因,并通过生物信息学GO分析和KEGG Pathways分析查找差异miRNA可能的富集功能和信号通路,并最终根据差异miRNA和预测靶基因构建miRNA-靶基因相互作用网络。结果:进行芯片分析以评估实验造模和对照组的肾组织中miRNA的表达差异,选择组间表达2倍或0.5倍的miRNA进行差异筛选。采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)分析验证芯片分析结果。为了预测miRNA在病理生理过程中的潜在作用,进行了GO分析、KEGG Pathway分析和靶基因预测。观察到总共28个miRNA在实验造模组和对照组之间显著差异表达(2倍)。在这些miRNA中,有20个被显著上调,另外8个被显著下调。GO和Pathway分析显示这些miRNA的变化可能与PI3K/AKT等信号通路的激活有关。结论:本部分发现多种miRNA的表达在乙二醇诱导的高草酸尿症大鼠的肾组织中发生改变。生物信息学的方法预测了多个与上述miRNA相关的细胞功能和信号通路。高草酸尿发病的潜在机制可能是miRNA对其靶基因表达调控所致。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R691.4
【部分图文】：

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华中科技大学博士学位论文22图1 通过以上方法，将Slc26a6序列插入慢病毒载体中成为pWSLV-05-Slc26a6（以下简称lv-Slc26a6）。将ds-siRNA抗-Slc26a6序列插入慢病毒载体中成为pLenti-siRNA（Slc26a6）-RFP（以下简称lv-siRNA-Slc26a6）。4. 实验方法4.1 患者标本收集1) 收集因草酸钙结石而严重肾积水需要肾切除手术的患者的肾脏皮髓交界处标本10 例，作为结石组；收集患者 24 小时尿液。2) 收集因肾肿瘤或肾结核而需要切肾的患者的远离病灶的正常皮髓交界处组织 10例，作为对照组。收集对照组 24 小时尿液。4.2 患者 24 小时尿液草酸浓度分析1) 配制离子色谱仪的 10 ppM 阴离子标准液试剂质量草酸 0.01 g枸橼酸 0.01 g磷酸二氢钾 0.014 g纯水 1.0 L2) 配制浓度为 0.5 ppM、1.0 ppM、2.0 ppM、5 ppM、10 ppM 的标准液。3) 通过离子色谱仪将标准液由 0.2 μM 微孔滤膜注入样品孔内，绘制标准曲线。4) 将 24h 尿液标本，用 1% 的浓盐酸进行酸化，用 0.3 mM 硼酸溶液稀释尿液溶液。透过微孔过滤注入色谱仪内。

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结石患者与对照组的尿草酸浓度比较。如图所示，结石尿草酸浓度显著高于对照组。组患者的肾脏进行 Western blot 分析，结果如图 2-2 所示水平高于非结石组患者。

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华中科技大学博士学位论文图 2-2. 草酸钙结石患者与对照组的肾脏内 SLC26A6 表达水平的 Western blot 分析比较。如图（A）所示：结石组患者的肾脏内 SLC26A6 表达水平高于对照组。（B）为SLC26A6/β-actin 的相对表达水平的柱状图。通过对两组患者的肾脏切片进行免疫组化分析，结果如图 2-3 所示，结石组肾脏的 Slc26a6 表达阳性水平高于非结石组患者。

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