转录因子RUNX3对前列腺癌细胞恶性表型的影响

发布时间：2020-09-26 17:24

　　 前列腺癌是美国男性发病率最高的恶性肿瘤,死亡率占恶性肿瘤的第二位。近年来随着诊断水平的提高,前列腺癌已能做到早期发现,经过标准化的治疗,包括根治性前列腺切除、雄激素阻断、局部放疗、冷冻消融和化疗等,基本已能治愈或维持现状。但对那些早期治疗失败或发现较晚的进展期前列腺癌,仍没有有效的治疗方法。因此,我们迫切需要一种改良的、有效的治疗方法,基因治疗提供了一种新的方式。RUNX基因家族包括:RUNX1,RUNX2,RUNX3。RUNX1与造血发生密切相关,其染色体易位在非白血性白血病中常见。RUNX2是成骨发生必需的,在颅骨锁骨发育不良中可见其改变。RUNX3定位于人1p36.1和小鼠第4同源染色体,包含有6个外显子,P1和P2两个启动子。RUNX3作为一个抑癌基因,通过编码PEBP2/CBF的α亚单位而介入TGF-β信号通路,起着抑制细胞增殖、血管形成及诱导细胞凋亡等作用,RUNX3功能的缺失导致多种肿瘤的发生。此外,RUNX3与脊髓背根神经节(DRG)的神经发生和T细胞分化密切相关。RUNX3基因的杂合性缺失以及P2启动子区域的Cp G岛的过甲基化是导致RUNX3基因沉默的主要机制,RUNX3蛋白胞浆转位(由细胞核转位进入胞浆中)可能是其丧失抑瘤作用的另一种机制。在RUNX3表达缺失的胃癌细胞加入HDAC抑制剂,能重新激活RUNX3基因,引起肿瘤生长抑制及诱导凋亡的发生。在胃癌细胞系中增强RUNX3的表达可下调cyclin D1,上调p27及caspases3,7,8的表达,诱导凋亡的发生,进而引起肿瘤生长及远处转移的抑制。在RUNX3联合阿霉素针对肝细胞癌的体内体外实验中,RUNX3能增强caspase-8及抑制Bcl-2的表达,抑制肿瘤的生长。RUNX3甲基化在前列腺癌中达到32.4%,在前列腺上皮内瘤变达到14.3%,而在正常或良性前列腺肿瘤组织中未发现,提示RUNX3可能参与前列腺癌发生的多个环节。本实验应用分子克隆技术构建含转录因子RUNX3的重组复制缺陷型腺病毒载体,再感染PC-3前列腺癌细胞,分析RUNX3在PC-3中的表达定位及对其对PC-3细胞增殖、凋亡、侵袭迁移等能力的影响,为前列腺癌的基因治疗奠定基础。目的:探讨转录因子RUNX3对前列腺癌细胞PC-3增殖、凋亡、侵袭、迁移等细胞学行为的影响。方法:构建重组复制缺陷型腺病毒p Ad-RUNX3,再感染PC-3细胞,western blot检测RUNX3的表达,间接免疫荧光分析其亚细胞定位;MTT法、平板克隆形成实验观察RUNX3对PC-3细胞株的生长抑制作用;Annexin-V染色流式细胞术检测RUNX3对PC-3细胞凋亡的诱导作用;Transwell小室实验分析其对PC-3细胞侵袭、迁移的抑制作用。结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建包含RUNX3的重组复制缺陷型腺病毒p Ad-RUNX3。感染PC-3前列腺癌细胞36 h后,结果显示腺病毒介导的RUNX3可在PC-3细胞中表达,其表达定位于细胞核中。腺病毒介导RUNX3可显著抑制PC-3前列腺癌细胞的体外生长能力及平板克隆形成能力(P0.05),感染PC-3细胞36 h后可检测到显著的细胞周期阻滞(P0.05)。25 MOI Ad-RUNX3感染PC-3细胞36 h后可诱导细胞凋亡(P0.05)。Transwell小室实验分析Ad-RUNX 3过表达24h后对PC-3侵袭及迁移有显著抑制作用(P0.05)。结论:成功构建出包含RUNX3的重组复制缺陷型腺病毒,通过感染PC-3细胞,证实RUNX3可在PC-3细胞核中表达。体外细胞实验证实重组腺病毒介导的转录因子RUNX3对PC-3细胞的生长、侵袭、迁移均有显著的抑制作用,并诱导细胞凋亡的发生。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

种于24孔板（105个/孔）；细胞融合80%时吸出醛固定30min，0.1M PBS冲洗3次，蒸馏水冲：从24孔板内取出细胞爬片，蒸馏水水化10，室温孵育20min；0.01M PBS冲洗3次，滴CY3偶联的兔抗鼠抗体），常温下避光反应35min，50%甘油封片，再以荧光显微镜观察pShuttle-CMV-RUNX3-flag 的构建和鉴定g 自质粒上酶切下，再连接至双酶切（No构建出 pShuttle-CMV-RUNX3-flag (见图 1) 。

第四军医大学博士学位论文RUNX3-flag 的构建和鉴定性化的 pShuttle-CMV- RUNX3-flag 以细菌，进行细菌内同源重组。提取阳性能释放出大小约 4. 5 kb 的片段(见图 2)。

PCR鉴定重组腺病毒pAd-RUNX3-flag

本文编号：2827263