Egr1通过肾脏RAS调控糖尿病肾脏疾病进展的作用及机制研究

发布时间：2020-10-12 02:29

　　 研究背景糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最主要的微血管并发症之一。RAS阻断剂治疗DKD的局限性为:无法有效抑制肾脏局部RAS系统激活,另外会导致局部肾素反馈性升高。因此,寻找有效的全面抑制肾脏局部RAS系统的方法可能是治疗DKD的新途径。早期生长反应蛋白1(Early Growth Response Protein 1,Egr1)是 DKD 进展中重要的转录因子之一。经生物信息学分析发现:RAS系统组分包括AGT,renin,ACE,AT1R启动子上均有Egr1的结合位点。因此,提出以下科学假设:Egr1通过上调RAS系统(AGT,renin,ACE,AT1R)促进DKD进展,敲减Egr1可以全面抑制肾脏RAS系统,延缓DKD进展,可能为DKD提供新的治疗途径。方法1动物实验(1)第一部分:高脂饮食及链脲佐菌素诱导C57BL/6小鼠建立DM模型,成模12w处死;(2)第二部分:DM小鼠12-16w采用流体力学方法每周尾静脉注射相应质粒,建立Egr1敲减及Egr1过表达DM小鼠模型。2细胞培养人肾近曲小管细胞(HK2)于RPMI-1640培养基(2.0g/L葡萄糖)+10%FBS中培养;小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES 13)及人胚肾293T细胞于含1.0g/L糖的DMEM培养基+5%FBS中培养,培养箱环境为:37℃、5%C02,据细胞生长情况传代、换液、铺板或进行其他实验操作。3细胞转染细胞转染的前一天,以60-80%的细胞密度平均接种于细胞培养板中,以无血清培养基饥饿24小时后,使用lipo3000进行转染,达到基因的过表达或敲减。4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)组织及细胞总RNA使用Trizol提取,一步法逆转录RNA为cDNA。使用SYBR试剂进行RT-qPCR反应,以β-actin作为内参,按2-△△Ct方法计算得出目的基因表达量。5 Western BlotRIPA法裂解并提取组织及细胞总蛋白。每孔蛋白上样量为20-50ug。采用10%的SDS-PAGE胶电泳分离样品蛋白,湿转到PVDF膜(0.45μm)上。然后使用5%脱脂奶粉或BSA封闭,一抗4℃摇床过夜孵育,二抗室温孵育1h。使用Odyssey近红外成像系统发光显影,采用Gel-Pro analyzer软件分析结果。6肾组织病理学及免疫组化分离并取出肾脏,石蜡包埋后制备3μm组织切片。PAS染色法和Masson染色法用于观察肾组织的纤维化程度;免疫组织化学法用于分析Egr1,RAS及纤维化指标的表达情况。7染色质免疫共沉淀细胞分为对照组、TGF-β1(2h)及TGF-β1(48h)刺激组,根据ChIP-ITR Express kit(Active Motif,Bedford,MA)试剂盒步骤进行操作,采用抗Egr1抗体或对照IgG来交联蛋白质-DNA,使用RT-qPCR来检测富集效应。使用标准曲线法计算富集倍数。8双荧光素酶报告基因构建ACE荧光素酶质粒(GV238-ACE),将不同浓度梯度Egr1质粒(pENTER-Egr1)和GV238-ACE共转染,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组海肾荧光及萤火虫荧光值。9激光共聚焦肾脏组织切片共染Egr1及AGT抗体,Leica TCS-SL共聚焦显微镜下观察共定位情况。10酶联免疫吸附法采用酶联免疫吸附法试剂盒分别检测血葡萄糖、糖化血红蛋白、肌酐、.血脂、尿白蛋白、肾组织AngII。11统计分析采用SPSS21.0统计软件分析实验数据,各指标数据采用均数±标准差(X±SD)表示。正态分布两两比较采用两独立样本t检验,非正态分布采用Mann-Whitney U检验。多组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。首先进行Levene方差齐性检验和方差分析,若方差齐(P0.05)且组间均数有显著性差异(P0.05),进一步采用LSD法作组间多重比较;若方差不齐(P0.05),选择近似F检验Welch法校正;若组间均数有显著性差异(P0.05),则采用Dunnett's T3法作多重比较;P0.05时被认为差异具有统计学意义。结果1 DM小鼠成模后12w,24h尿白蛋白明显升高,肾皮质中Egr1及RAS(AGT,renin,ACE,AT1R)的mRNA及蛋白表达水平均升高。2重组人TGF-β1蛋白干预HK2细胞后Egr1的mRNA及蛋白水平呈一过性瞬时升高,RAS(AGT,renin,ACE,AT1R)的mRNA及蛋白表达水平均升高。随着Egr1 浓度(Oug,1ug,2ug,4ug)升高,AGT,renin,ACE,AT1R mRNA 及蛋白逐渐升高。敲减Egr1后,AGT,renin,ACE,AT1RmRNA及蛋白随之下调。3 DM小鼠肾皮质激光共聚焦显示Egr1与AGT共定位。4染色质免疫共沉淀实验证实AGT,renin,ACE,AT1R基因启动子上存在Egr1的结合位点,TGF-β1刺激后AGT,renin,ACE,AT1R富集效率增加。5 293T 细胞转染 pENTER-Egr1 质粒(0.2,0.4,0.6,0.8,1.Oug)及 ACE 启动子质粒后,萤火虫荧光素酶活性逐渐升高。6DKD小鼠过表达Egr1后,24h尿白蛋白明显升高,血肌酐明显升高。肾组织AGT,renin,ACE,AT1R 的 mRNA 及蛋白均升高。7 DKD小鼠敲减Egr1后,24h尿白蛋白明显下降,肾组织AGT,renin,ACE,AT1R mRNA及蛋白均下降。切片蓝染胶原纤维减少,纤维化程度减轻。纤维化因子FN,α-SMAmRNA及蛋白均下降;CTGF及TNF-α蛋白表达降低。结论1 RAS 组分(AGT,renin,ACE,AT1R)均是 Egr1 的靶基因。2下调Egr1可以延缓DKD进展,可能的机制之一为抑制RAS的激活。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

??进作用［１２］（图１）。肾脏组织中存在可以生成Ａｎｇｌｌ的所有组分。免疫荧光发现??ＡＧＴ定位于近曲小管及肾小球，远曲小管及集合管未见阳性结果［１３＿１５］。体外培??养肾脏近曲小管细胞可检测到ｒｅｎｉｎ?ｍＲＮＡ和ｒｅｎｉｎ样活性，大鼠肾小管液中也检??测到了低浓度的肾素［１６，１７］。人肾脏近曲小管刷状缘可检测到大量ＡＣＥ?ｍＲＮＡ及??蛋白［１８，?１９］，另外近曲小管及远曲小管液中检测到ＡＣＥ，近曲小管液中含量高于??远曲小管Ｐ〇］。??既往研宄证实，在ＤＭ状态下，与全身循环ＲＡＳ无关的肾脏局部ＲＡＳ被激??活是导致ＤＫＤ发生发展的重要因素之一［１２］。高糖刺激可以使肾小球和近端小管??Ａｎｇｌｌ生成增多，此时肾脏局部Ａｎｇｌｌ的浓度是血浆的数倍［２１］。可能的机制有：??通过Ｐ３８?ＭＡＰＫ通路可以使近端小管ＡＧＴ基因表达增加，从而刺激Ａｎｇｌｌ合成［２２］；??高糖作用下肾小球系膜细胞ＡＧＴ表达也会明显升高

Ｅｇｒｌ是肾脏纤维化重要的调控因子，在ＤＫＤ进展中发挥重要作用。??经生物信息学分析（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ／）发现：ＲＡＳ系统组分包括??ＡＧＴ，?ｒｅｎｉｎ，ＡＣＥ，?ＡＴ１Ｒ启动子上均有Ｅｇｒｌ的结合位点（图２）。因此，Ｅｇｒｌ??可能是调控肾脏局部ＲＡＳ激活的关键转录因子，抑制Ｅｇｒｌ可能会全面抑制肾??脏局部ＲＡＳ，从而为治疗ＤＫＤ提供新的途径。本课题组拟通过体内外实验探??索上述科学假设。??ｒｅｎｉｎ?ＩＡ０１Ｓ２．２?ＥＧＲ１?１１．３７３?０．９０１９７５３３５２１８２５１?１２４６?１２５９?１?ｃｄｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇ??ＡＣＥ?動痕?２?ＥＧＲ１?２０?５２６?０．９９９９９６２９９７５５１１１?１９３６?１９４９?－１?ｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃ??ＡＧＴ?ＩＡ０ｌＳ２：２?ＥＧＲ１?９．１２０?０?８Ｉ７８４７Ｓ９２０６２８３３?１３２？?１３４０?１?ｇｃｃｔｃａｃｃｃａｃｔｇｃ??ＡＴ１Ｒ?ＩＡ０１Ｅ２?ＥＧＲ１?１０．４９５?０?８９２５７２６９０５２６５２６?１９８１?１９９４?－１?

ｍｍｏ５．８３±０．２１?２２．３０±０．８３糖化血红蛋白（％）?５．４５±０．５４?９．４５士０．２５”??２４ｈ?尿白蛋白（ｕｇ）?６．１６士０２４?８０．３４±２．２４＊＊??肌酐（ｍｍｏｌ／Ｌ）?１７７．６７±２１．８５?１７４．１８±２．１１??Ｐ＜０．０５ｖｓ?Ｃｏｎｔｒｏｌ，?＊?Ｐ＜０．０１?ｖｓ?Ｃｏｎｔｒｏｌ，?Ｎ＝６??２组织形态学检查??２．１?ＰＡＳ染色法观察两组肾组织肾小球及肾小管间质胶原纤维的变化??从ＰＡＳ染色结果观察到：Ｃｏｎｔｒｏｌ组小鼠的肾组织显示了正常的肾小球构，清晰的Ｂｏｗｍａｎ’ｓ囊和毛细血管丛，肾小管结构排列整齐。而ＤＭ组小肾小球毛细血管基底膜明显增厚，系膜基质弥漫性增多，在图中呈深紫红色，??肾小管管壁组织疏松水肿、排列紊乱（图Ｍ）。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＤＭ??％，?＇?‘?－?－ｖ?－?：?：?Ｔ＇?１??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Sonoo Mizuiri;Yasushi Ohashi;;ACE and ACE2 in kidney disease[J];World Journal of Nephrology;2015年01期

本文编号：2837498