线粒体相关蛋白表达变化和活性氧簇生成参与顺铂诱导急性肾损伤

发布时间：2020-10-18 21:02

　　 背景:顺铂是常用治疗肿瘤的药物,也是药物性急性肾损伤的主要病因之一,其诱导肾小管上皮细胞损伤的机制较复杂。除了直接损伤细胞DNA外,活性氧簇(ROS)和ROS产生的主要细胞器线粒体损伤是否参与了顺铂诱导的急性肾损伤发生还需要进一步研究。目的:在顺铂诱导的急性肾小管损伤中,是否存在线粒体呼吸链蛋白表达变化和ROS生成。方法:体内研究中将Balb/c小鼠分为对照组和顺铂组(顺铂腹腔注射)进行实验。体外实验中使用不同浓度顺铂孵育HK-2细胞。生化检测血清肌酐、尿素氮,PAS、PASM肾脏病理改变,TUNEL及免疫荧光染色观察肾脏细胞凋亡以及cleaved caspase3的表达。免疫组化染色观察F4/80阳性细胞表达。Western Blot观察cleaved caspase 3/caspase 3,超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(catalase),谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4),线粒体分裂动力蛋白1(DRP1),磷酸化线粒体分裂动力蛋白1(P-DRP1),线粒体分裂蛋白受体1(FIS1),线粒体外膜融合蛋白(MFN1),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶1(ND1),NADH脱氢酶2(ND2),NADH脱氢酶3(ND3),NADH脱氢酶4(ND4),NADH脱氢酶4L(ND4L),Real-time PCR检测BAX、Bcl-2、Bcl-xl及线粒体DNA拷贝数,免疫荧光观察ROS与细胞凋亡,DCFH-DA检测细胞ROS生成,JC-1检测线粒体膜电位改变。结果:对照组和顺铂组小鼠的肌酐分别为8.79±1.21μmol/L和68.03±1.16μmol/L(P0.05),两组尿素氮分别为16.00±5.29mmol/L和42.33±5.51mmol/L(P0.05)。PAS染色见顺铂组小鼠肾脏小管上皮细胞肿胀明显,空泡样变显著。顺铂组小鼠肾脏中F4/80阳性细胞较对照组显著增多。TUNEL染色显示顺铂组较对照组细胞凋亡增多,和对照组比较顺铂组cleaved caspase 3/caspase 3表达增加了206.04±26.94%(P0.05)、Bax较对照组上调825.35±60.69%(P0.05),Bcl-2、Bcl-xl分别较对照组下调了99.20±11.55%(P0.05)、86.26±28.35%(P0.05)提示存在细胞凋亡。顺铂组cleaved caspase 3和3硝基酪氨酸(3-NT)荧光共染较对照组显著增多,顺铂组较对照组的SOD、catalase、GPX4基因转录分别下降了99.45±6.65%(P0.05)、89.27±1.01%(P0.05)和76.59±14.73%(P0.05),蛋白表达分别下降了59.50±16.26%(P0.05)、60.00±2.83%(P0.05)和57.00±14.14%(P0.05)。在体外实验中,顺铂浓度依赖地降低了HK-2细胞的线粒体膜电位。200μM处理组cleaved caspase 3/caspase 3增加了1.55±0.18倍(P0.05),20μM、100μM、200μM顺铂孵育使细胞Bax转录分别上调了3.63±0.28倍(P0.05)、4.33±0.19倍(P0.05)、5.67±0.40倍(P0.05),Bcl-2转录下降了64.69±1.15%(P0.05)、84.74±9.22%(P0.05)、73.00±20.93%(P0.05)。ROS荧光显示200μM顺铂组荧光显著增强。20μM、100μM和200μM处理组SOD表达分别下降了16.85±4.88%(P0.05),20.02±8.92%(P0.05),41.29±8.62%(P0.05);catalase表达分别为对照组的1.11±0.15倍(P0.05),0.61±0.04倍(P0.05),0.15±0.02倍(P0.05);GPX4表达分别下降了43.94±11.44%(P0.05),47.37±7.11%(P0.05),49.08±8.09%(P0.05)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制ROS后改善顺铂诱导的细胞凋亡。顺铂导致Balb/c小鼠FIS1蛋白表达为对照组的1.71±0.43(P0.05),P-DRP1/DRP1表达为0.68±0.35(P0.05),MFN1下降49.53±25.45%(P0.05)。顺铂组mt DNA拷贝数较对照组下降62.74±3.26%(P0.05),线粒体复合体I ND1、ND2、ND3基因转录较对照组分别下降47.35±2.49%(P0.05)、46.99±4.69%(P0.05)和54.60±2.33%(P0.05),ND1、ND3、ND4、ND4L蛋白表达下降45.89±15.79%(P0.05)、48.66±6.29%(P0.05)、45.12±11.66%(P0.05)、47.41±8.18%(P0.05)。20μM、100μM和200μM顺铂处理组P-DRP1/DRP1表达为0.32±0.24(P0.05)、0.45±0.23(P0.05)、0.12±0.47(P0.05),200μM处理组FIS1蛋白表达为对照组的2.17±0.21(P0.05),MFN1蛋白表达为对照组的0.41±0.09(P0.05)。200μM处理组线粒体复合体I中ND1、ND2、ND3转录分别为对照组的0.29±0.22(P0.05)、0.05±0.07(P0.05)、0.05±0.02(P0.05)。结论:顺铂可以诱导急性肾损伤发生,肾小管上皮细胞凋亡增加。线粒体复合体I蛋白变化和ROS产生可能参与了顺铂诱导的急性肾损伤。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：

小鼠肾功能

- 27 –Figure 3. pathological changes of kidney in mice图 3 小鼠肾脏 PAS、PASM 肾脏病理。放大 200 倍1.3.5 顺铂组小鼠肾脏组织 F4/80 染色示巨噬细胞增多我们对肾脏组织行 F4/80 免疫组化染色，顺铂组小鼠肾脏组织阳性染色显著较对照组增多，提示顺铂导致急性肾损伤中伴随炎症细胞浸润，如图 4。

上海交通大学硕士学位论文蓝色荧光为 dapi，箭头提示绿色荧光与蓝色荧光共定位显示。1.3.7 顺铂组小鼠肾脏组织中 cleaved caspase 3 表达增高Western Blot 检测顺铂组与对照组小鼠肾脏组织中 cleaved caspase 3/caspase 3相对表达，结果显示顺铂组 cleaved caspase3/caspase3 较对照组升高 2.60±0.27（P＜0.05）如图 6，提示顺铂通过 caspase 途径诱导细胞凋亡。
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本文编号：2846808