MiR-199a-3p在男性生殖细胞肿瘤中的抑癌作用研究

发布时间：2020-10-23 14:15

　　 睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumor,TGCT)是一类发生于睾丸或睾丸附近的肿瘤,近年来发病率有所增加,受到广泛关注。TGCTs的形成与睾丸先天性发育不良、遗传因素、某些基因突变以及信号通路异常有关。目前对其发病机制的了解还非常有限。microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)是本课题组前期在GC-1 spg细胞中筛选得到的受TGF-β1调节的mi RNA分子,参与男性生殖发育。已有研究表明,miR-199a-3p在癌症的发生发展过程中也发挥重要作用。为了探讨miR-199a-3p在睾丸生殖细胞肿瘤中的功能及调控机制,本论文开展了以下几个方面的工作:1.探讨了miR-199a-3p在睾丸肿瘤细胞中的生物学效应以人睾丸畸胎瘤瘤细胞Ntera-2和小鼠精原上皮细胞GC-1 spg为研究材料,通过MTT、划痕及流式细胞实验检测了miR-199a-3p对细胞的增殖能力、迁移能力、细胞周期及凋亡的影响。结果表明miR-199a-3p可以抑制Ntera-2和GC-1 spg细胞的增殖、迁移,但不影响细胞凋亡。此外,在Ntera-2细胞中我们观察到了mi R-199a-3p对细胞周期阻滞的现象。以上结果提示miR-199a-3p在睾丸生殖细胞肿瘤中发挥抑制因子作用。2.发现了miR-199a-3p靶向调控Nme2基因的表达Nme2基因是一个肿瘤转移抑制因子,与肿瘤的侵袭转移密切相关。通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因检测及定量PCR实验,我们发现:miR-199a-3p靶向识别Nme2基因的3'UTR序列;对miR-199a-3p的抑制能明显下调Nme2的表达。3.初步证实了miR-199a-3p及Nme2在TGF-β通路中的作用相互关联利用TGF-β1处理GC-1 spg细胞后,结果显示Nme2和miR-199a-3p在mRNA水平的表达均随TGF-β1浓度升高而上调;进一步利用miR-199a-3p和TGF-β1双重作用于GC-1 spg后,结果显示Nme2的表达会显著上调。已有研究表明,Nme2在TGF-β通路中发挥负反馈调节作用。我们推测在TGF-β1通路中,mi R-199a-3p被抑制的部分功能可能会被Nme2补偿。4.探讨了mi R-199a-3p对Ntera-2细胞代谢的影响生化分析结果表明,在Ntera-2细胞中,抑制mi R-199a-3p后,其乳酸含量显著提升,表明miR-199a-3p影响Ntera-2细胞的代谢过程。在此基础上,进一步利用qPCR array技术筛选获得了12个受miR-199a-3p调控的代谢基因,其中上调基因2个,下调基因10个。5.在临床睾丸肿瘤标本中验证了mi R-199a-3p与其调控的代谢基因的关系我们首先利用GEO数据库分析了不同的正常组织及其相应的肿瘤组织中miR-199a-3p的表达丰度,结果显示miR-199a-3p的表达具有组织特异性,在不同组织中分别发挥抑癌或促癌作用,其中在人类TGCT组织中发挥抑癌作用。对临床睾丸肿瘤标本的定量PCR分析结果表明,miR-199a-3p在睾丸肿瘤中表达下调,表明其的确发挥抑癌作用。进一步分析发现,在12个受miR-199a-3p调控的代谢基因中,其中有4个基因(LDHA,MCT1,PGK1和TIGAR)的表达与miR-199a-3p在临床睾丸肿瘤标本中的表达相反,这与它们在Ntera-2细胞中存在互反关系的结果一致,表明LDHA,MCT1,PGK1和TIGAR很可能为miR-199a-3p在代谢通路中的靶基因。综上,本论文明确了miR-199a-3p在睾丸肿瘤中发挥抑癌作用;确定了mi R-199a-3p靶向调控Nme2的表达;初步证实miR-199a-3p与Nme2在TGF-β通路中的作用相互关联;发现miR-199a-3p参与了肿瘤的糖代谢过程,并筛选获得12个受miR-199a-3p调控的代谢相关基因,其中LDHA、MCT1、PGK1和TIGAR可能为其潜在的靶基因。由此,我们认为miR-199a-3p可通过不同途径在男性生殖细胞肿瘤中发挥抑癌作用,可能是睾丸肿瘤预后和治疗的潜在生物标志物。
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.2
【部分图文】：

长分化因子( GDF)等[62]。其信号通路的基因多效性、信号协调性和依赖性在细胞的增殖迁移、分泌、分化，以及胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面发挥作用，具有广泛的生物学效应。TGF-β/smads 信号通路是一个精密的信号级联反应通路，其参与分子或信号传递紊乱，都可致信号转导过程异常，进而影响 TGF-β 调控的生物学活动。Smad 蛋白家族作为 TGF-β 信号通路的关键一员，与 TGF-β 共同形成经典的 TGF-β/smad 信号通路，从而调控复杂的生物学效应。目前已知 9 种 Smad 蛋白，以其结构和效应分为 3 个子类：①Smadl、2、3、5、8、9 属于受体激活型 Smad (receptor-activated Smad,R-Smad)。其中Smad2、3 可直接被 TGF-β 激活，成为 TpRI 激酶的底物，从而被磷酸化；②Smad4 能与 活 化 的 Smad 形 成 异 源 多 聚 体 ， 其 为 哺 乳 动 物 中 仅 有 的 通 用 型 Sma(common-partnerSmad,Co-Smad)，其在信号转导中起瓶颈作用，辅助活化蛋白进入细胞核，将胞外信号转导致胞内，调节靶基因的转录[63]；③Smad6、7 等属于抑制型Smad(inhibitory Smad，I-Smad)，主要作用是阻断 R-Smad 磷酸化、与磷酸化的受体或受体激活的 Smads 竞争性结合，抑制异源多聚体的活性、阻碍磷酸化的 R-Smad 与 Co-Sma异源多聚体形成等，从而对 TGF-β/smad 信号产生抑制作用。

MiR-199a-3p 在男性生殖细胞肿瘤中的抑癌作用研究进行 Poly(A)加尾处理。TaKaRa 公司的 miRNA PrimeScript RT Enzyme M(A) Polymerase 和反转录酶 PrimeScript RTase，可将 miRNA 加尾后随即逆在此过程中，还引入了 Uni-miR qPCR Primer 的结合位点，可以利用这一任何 cDNA 进行定量 PCR 反应。原理图如下（图 1.1）：

图 2.2 qPCR 检测 miR-199a-3p 合成物的转染效率2.3.2 miR-199a-3p对Ntera-2和GC-1 spg细胞增殖的影响以 Ntera-2 和 GC-1 spg 细胞作为实验模型，利用 MTT 实验，检测 miR-199a-3p 对Ntera-2 和 GC-1spg 细胞的增殖能力的影响。图 2.3 表示 miR-199a-3p mimics 以及miR-199a-3p inhibitor 分别转染 0 h，24 h 和 72 h 后 Ntera-2 细胞（a）和 GC-1 spg 细胞（b）的存活率。从图中可以看出，在 24 h 内，无论 Ntera-2 还是 GC-1 spg 细胞，相比于 NC 对照组，miR-199a-3p mimics 转染组或 miR-199a-3p inhibitor 转染组，细胞的存活率变化均无显著性差异。但在 72 h 后，转染了 miR-199a-3p mimics 组的细胞存活率明显下降，表明 miR-199a-3p 抑制了 Ntera-2 和 GC-1 spg 细胞的生长。
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本文编号：2853144