人膀胱癌T24细胞多柔比星耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究

发布时间：2020-10-26 23:00

　　 研究背景及目的膀胱癌是泌尿系统中常见的肿瘤,世界范围内,膀胱癌最常见的组织学类型是移行细胞癌,占膀胱癌总数的90%,约75%的初发者为浅表性膀胱移行细胞癌。其传统的治疗方法是经尿道切除病变,然后膀胱内注入化疗药物。由于膀胱癌具有易复发、转移及耐药等生物学特性,因此长期进行膀胱灌注化疗的患者,易对药物产生抵抗,进而加速肿瘤的恶化,导致癌症相关死亡。故阐明膀胱癌的耐药机制,以期逆转耐药成为膀胱癌临床治疗的关键问题。目前对于耐药机制的研究大多基于编码基因到蛋白质层面,并不能很好的解释肿瘤耐药问题。随着表观遗传学研究的不断深入,非编码RNA在医学领域引起越来越多的关注。已有相关研究表明非编码 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs),如小 RNA(micro RNA,miRNAs)、长链非编码RNA(long-noncoding RNAs,lnc RNAs)等均参与介导肿瘤耐药的发生。然而关于lnc RNAs参与调控人膀胱癌耐药的机制尚未阐明。为探讨lnc RNAs参与人膀胱癌耐药的具体机制,本研究拟:①构建膀胱癌T24多柔比星耐药株,验证耐药性,初步探讨耐药机制;②高通量测序、生物信息学分析筛选亲本株与耐药株差异表达的lnc RNAs。研究方法采用体外大浓度多柔比星(Doxorubicn,DOX)结合时间递增冲击诱导构建人膀胱癌多柔比星耐药细胞株T24/DOX;倒置显微镜下观察不同阶段亲本株T24、耐药株T24/DOX细胞形态学改变;CCK-8法检测不同阶段亲本株T24、耐药株T24/DOX的IC50,计算耐药指数(RestitanceIndex,RI);分别绘制亲本株T24、耐药株T24/DOX生长曲线、计算倍增时间,初步衡量T24/DOX细胞耐药性;平板克隆形成实验检测T24亲本株和T24/DOX耐药株的单细胞克隆形成能力;罗丹明123(Rh123)蓄积实验检测T24亲本株和T24/DOX耐药株细胞内罗丹明蓄积量,检测耐药相关蛋白P-gp的活性;PI/Hoechst33342双染检测T24亲本株和T24/DOX耐药株在不同药物浓度下的细胞凋亡率;Western Blot检测T24亲本株和T24/DOX耐药株细胞内耐药相关蛋白的表达,初步探索T24/DOX耐药机制;采用皮下移植瘤法建立T24亲本株、T24/DOX耐药株的裸鼠移植瘤耐药模型,在体验证T24/DOX耐药性及其机制;高通量测序筛选T24亲本株和T24/DOX耐药株差异表达的lnc RNA。研究结果1.T24/DOX耐药细胞株建立:成功建立了人膀胱癌T24/DOX耐药细胞株(耐药株与亲本株同源);亲本株T24和耐药株T24/DOX的IC50值分别为247.6 ng/ml、3221 ng/ml,RI 为 13.01。2.耐药性的验证:倒置显微镜下可观察到耐药株T24/DOX较亲本株T24细胞形态发生了明显改变,变形细胞比例增大;细胞生长曲线显示,亲本株T24和耐药株T24/DOX细胞的倍增时间分别为(53.41 ± 8.24)h和(44.36 ± 6.64)h,即与亲本株T24相比,T24/DOX耐药细胞株的倍增时间延长(P0.05)。亲本株T24和耐药株T24/DOX细胞克隆形成率分别为(18.4±1.83)%和(44.93±3.03)%,与T24细胞相比,T24/DOX克隆形成率明显增多(P0.01);Rh123蓄积实验结果显示,与T24细胞(6.43±0.75%)相比,T24/DOX耐药细胞内荧光强度明显减弱,阳性细胞率也明显减少(2.15±0.81)%(P0.01);PI/Hoechst33342染色结果显示在不同的药物浓度(DOX 2.5、1.25、0.625 μg/ml)作用下,与T24细胞相比,T24/DOX红色荧光均减少(P0.05);成功建立裸鼠移植瘤体内耐药模型,成瘤率大于90%。T24裸鼠移植瘤抑瘤率为76.18%,T24/DOX裸鼠移植瘤抑瘤率为32.23%(P0.05)在体实验发现T24/DOX具有明显的耐药性。3.T24亲本株与T24/DOX耐药株中耐药相关蛋白的表达:与T24细胞相比,T24/DOX耐药细胞株中Bcl-2表达量升高,Bax/Bcl-2比率显著降低(P0.05),P-gp蛋白表达量升高(P0.01),caspase-3的表达降低(P0.05);裸鼠移植瘤组织中蛋白表达,在对照组中与T24裸鼠移植瘤相比,T24/DOX组Bcl-2表达量升高,Bax表达量降低,Bax/Bcl-2比值降低(P0.01),Caspase-3的表达降低(P0.01);在给药组中与DOXT24裸鼠移植瘤相比,组Bcl-2表达量升高,Bax表达量降低,Bax/Bcl-2比值降低(P0.05),Caspase-3的表达降低(P0.05),裸鼠瘤组织中蛋白表达情况与细胞中表达情况一致。4.高通量测序结果:分别对T24、T24/DOX(RI分别为6.12和13.01)三株细胞进行高通量测序,筛选出292个新lnc RNAs。与T24细胞相比,T24/DOX(RI分别为6.12和13.01)中具有差异表达的lnc RNAs均有11个,其中两株耐药细胞中共有表达的lnc RNAs有5个,分别为MSTRG.14409(FC-1.5)、MSTRG.16907(FC0)、MSTRG.121(FC0)、MSTRG.17(FC0)、MSTRG.16359(FC1.5)。研究结论1.建立了稳定的人膀胱癌多柔比星耐药细胞株T24/DOX;2.T24/DOX的耐药机制与抑制细胞凋亡、P-gp蛋白的表达升高有关;3.高通量测序结果显示,耐药株T24/DOX与亲本株T24存在异常表达的lnc RNAs。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.14
【部分图文】：

（Ａ）?Ｔ２４?（Ｂ）?Ｔ２４／ＤＯＸ??１．３．２?Ｔ２４／ＤＯＸ耐药株的建立??Ｔ２４亲本株对ＤＯＸ的ＩＣ５Ｑ为２４７．６ｎｇ／ｍｌ。经过历时１０个月的诱导，检的ＤＯＸ对细胞的ＩＣ５Ｑ，观察Ｔ２４／ＤＯＸ耐药株耐药指数的变化。Ｔ２４／ＤＯ逐渐变大，最终为３２２１?ｎｇ／ｍｌ，耐药指数达到１３．０１，诱导后的Ｔ２４细胞感性显著降低，呈现出明显的耐药性。??ｊ２４?Ｔ２４?２．５ｎｇ／ｍｌ?８ｈ（３）??〇〇－｜?？?！＊？？＊？＊？??Ｉｓ?Ｓ?１００＃??．?ｉｃ５０＝２４７．６ｎｅ／ｍ］?？?８〇—?ＩＣ５０＝３２２６〇－????Ｉ－?Ｘ???４０＇?＊?＇１?４０－?Ｓ?＼??，０－?￡?２０－??０?ｉ?■■?ｉ?■?ｉ?ｉ?〇ｌ?？?？?？?？?ｉ??１?１０?１００?１０００?１００００?１?１０?１００?１０００?１００００?１００Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍｌ）?Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍＩ）??

１．３．１?Ｔ２４亲本株和Ｔ２４／ＤＯＸ耐药株细胞形态学的变化??倒置显微镜观察并记录Ｔ２４亲本株和Ｔ２４／ＤＯＸ耐药株不同阶段的细胞形态学??变化。在显微镜下，如图１．１Ａ所示，Ｔ２４亲本株细胞大小均一，形状规则。加入??ＤＯＸ刺激，撤药后约２４?ｈ后可观察到细胞大量死亡，未发现形态上的明显改变。??期间每两天更换一次新鲜培养基清除死细胞，剩余的极少数细胞贴壁生长，剩余的??细胞体积明显增大，空泡增多，有的细胞出现突起如图１．１Ｂ所示。随着撤药时间??延长，存活的细胞开始恢复生长，但恢复后的细胞体积较大，出现肿胀变形，细胞??形态表现为大小不一，形状不规则，喜聚团生长。??８??

?８??Ｔｉｍｅ?（ｄ）??图２．１?Ｔ２４和Ｔ２４／ＤＯＸ的细胞生长曲线??２．３．２克隆形成实验??单细胞独立生长能力由克隆形成实验测定，当单个细胞在体外持续分裂增殖６??次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或者集落，通常情况下，每个克隆含??有５０个以上的细胞。通过计算克隆形成率，可以对细胞独立生长能力定量分析。??由图２．２可见，与Ｔ２４亲本株（１８．４±?１．８３）?％相比，Ｔ２４／ＤＯＸ耐药株克隆形成率??（４４．９?±３．０３）?％明显升高，克隆形成能力较强（芦＜?０．０１）。由此可见Ｔ２４／ＤＯＸ耐??药细胞株的增殖能力明显强于Ｔ２４亲本株细胞。??Ａ?Ｂ??Ｔ２４?Ｔ２４／ＤＯＸ??一?５０］??＿?？?Ｖ，４０．??＇／？？？、?１?＿藝??？?＇?＇?Ａ?／?＼?Ｉ?３０－?■！！??１?纏鬚繼藝??ｒ?？?？?坌?２０－?＿＿讓??ｉ?ｐｉｉｎ?ｍｍｍ??’？?．广?Ｐ－?〇?ｈ?ｔ?１?ｆ麵ｙ?沴?ｊ??？?？?＊?＊?．?Ｆ２４?１２４／１）０?Ｘ??图２．２Ｔ２４和Ｔ２４／ＤＯＸ克隆形成率（ｎ＝３），?“与Ｔ２４相比，尸＜
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本文编号：2857642