核受体NR2E1在糖尿病肾病中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-26 23:11

　　 目的:探讨孤儿核受体 NR2E1(nuclear receptor subfamily 2,group E,member 1)在小鼠肾脏组织及肾小球系膜细胞中的表达情况,研究NR2E1对高糖条件下肾小球系膜细胞损伤的影响及NR2E1在小鼠糖尿病肾病中的作用。方法:利用蛋白质印迹法(Western-blot)、免疫组化及免疫荧光方法检测NR2E1在小鼠肾脏及肾小球系膜细胞中的表达情况。体外培养小鼠肾小球系膜细胞系SV40MES13,利用慢病毒载体感染技术,建立稳定过表达NR2E1(OE-NR2E1)及相应空载对照(OE-Ctrl)细胞系、稳定干扰NR2E1表达(KD-NR2E1)及相应空载对照(KD-Ctrl)细胞系。利用噻唑蓝法(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zoliumbromide,MTT)检测高糖条件下(30mmol/L 葡萄糖培养)各组细胞的增殖活力;实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,QRT-PCR)及蛋白质印迹法检测细胞增殖、炎症、促纤维化相关基因、Sirtl(silent mating type information regulation 2 homolog 1)、核受体辅助调节因子 PGC-lα(Peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator)和 RIP 140(Receptor interaction protein 140)表达。8周龄雄性基因敲除杂合子NR2E1+/-小鼠(KD)与对应的同窝野生型NR2E1+/+小鼠(WT)各20只,随机分为以下四组:(1)基因敲除杂合子NR2E1+/-小鼠10只,标记为KD组;(2)基因敲除杂合子NR2E1+/-糖尿病肾病小鼠10只,标记为KD-DN组;(3)正常野生型小鼠10只,标记为WT组;(4)野生型糖尿病肾病小鼠10只,标记为WT-DN组。KD-DN组和WT-DN组小鼠按照50 mg/kg体重腹腔注射STZ溶液,连续5天。WT组和KD组小鼠腹腔注射相应体积的无菌柠檬酸钠缓冲液(浓度为50mmol/L),连续5天。血糖超过16.7mmol/L认为糖尿病造模成功。所有小鼠继续饲养12周后,检测小鼠摄食量、血糖、体重、肾脏指数、血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白排泄量。提取肾脏组织,通过PAS染色、Masson染色、免疫组化和Westem-blot方法检测肾脏糖原积累、胶原纤维沉积及炎症、促纤维化相关基因、Sirtl及核受体辅助调节因子PGC-lα和RIP140的表达情况。结果:核受体NR2E1在小鼠肾脏及SV40 MES13细胞中均存在表达,且NR2E1主要表达于细胞核。在5 mmol/1葡萄糖条件下,过表达NR2E1不影响SV40 MES13细胞的增殖活力和增殖相关基因PCNA、炎症相关基因NF-κB p-P65及促纤维化基因TGF-βi的表达水平,但能显著增加Sirtl和PGC-lαα表达、降低RIP140表达。在30 mmol/1葡萄糖条件下,过表达NR2E1可以抑制高糖诱导的SV40MES13细胞增殖、炎症、促纤维化相关基因表达,升高Sirt1和PGC-1αα降低RIP140表达;而干扰NR2E1表达则可起到相反的作用。KD组与WT组之间,小鼠摄食量、血糖、体重、肾脏指数、血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白排泄量、肾脏糖原和胶原纤维积累、炎症、促纤维化基因、Sirt1、PGC-1α及RIP140表达均无明显差异。与WT组相比,WT-DN组小鼠体重下降、Sirt1和PGC-1α表达明显降低,摄食量、血糖、肾脏指数、血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白排泄量明显升高,糖原及胶原纤维沉积、系膜基质增生明显,RIP140、炎症相关基因和促纤维化基因表达明显升高。与WT-DN组相比,KD-DN组小鼠Sirt1和PGC-1α表达进一步降低,摄食量、血糖、肾脏指数、血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白排泄量则进一步升高,糖原及胶原纤维沉积、系膜基质增生更显著,RIP140、炎症相关基因和促纤维化基因表达进一步增加。结论:NR2E1在小鼠肾脏和肾小球系膜细胞中存在表达,上调NR2E1能改善高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤;NR2E1表达降低促进小鼠糖尿病肾病的进展;NR2E1可能是通过调控Sirt1、PGC-1α和RIP140表达发挥作用的。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

?武汉大学博士学位论文???３结果??３．１?ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾脏组织和肾小球系膜细胞中的表达分析??利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法分析成年雄性Ｃ５７小鼠肾脏组织，结果表明在小鼠肾??脏中存在ＮＲ２Ｅ１表达（图１．１Ａ）。免疫组织化学分析显示，ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾脏??中存在表达，且ＮＲ２Ｅ１主要表达于肾小球，在肾间质表达较弱（图１．１Ｂ）。??为了进一步分析ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾小球系膜细胞中的表达情况，我们采用??Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ和免疫荧光法分析，结果显示ＳＶ４０?ＭＥＳ１３细胞中存在ＮＲ２Ｅ１表达，??且主要表达于细胞核，在胞浆中存在较弱表达（图１．２）。??

３．１?ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾脏组织和肾小球系膜细胞中的表达分析??利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法分析成年雄性Ｃ５７小鼠肾脏组织，结果表明在小鼠肾??脏中存在ＮＲ２Ｅ１表达（图１．１Ａ）。免疫组织化学分析显示，ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾脏??中存在表达，且ＮＲ２Ｅ１主要表达于肾小球，在肾间质表达较弱（图１．１Ｂ）。??为了进一步分析ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾小球系膜细胞中的表达情况，我们采用??Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ和免疫荧光法分析，结果显示ＳＶ４０?ＭＥＳ１３细胞中存在ＮＲ２Ｅ１表达，??且主要表达于细胞核，在胞浆中存在较弱表达（图１．２）。??Ａ?Ｂ??Ｉ：霍自義??３藤；和於、．??Ｎ?，?■？?ｆ?＼?／??？，＊．?■＊－?？?？?？??＊？?Ｃｌ：ｔ?＊?＇?ｍ?？？?？??图１．１?ＮＲ２Ｅ１在小鼠肾脏组织中的表达分析??注：Ａ

件下其表达水平显著升高，但是随着刺激时间的延长（３６?ｈ，?４８?ｈ），其表达水平??呈现逐渐降低的趋势，至４８?ｈ时，己明显低于对照组。在后续研究中，我们使??用葡萄糖作用时间为４８?ｈ。（图１．３）??由于本研宄中我们使用的葡萄糖浓度较高（３０?ｍｍｏｌ／ｌ），培养条件渗透压较对??照组（ＳＶ４０?ＭＥＳ１３组，葡萄糖浓度为５?ｍｍｏｌ／ｌ）也升高。为了排除ＮＲ２Ｅ１表??达的改变是由于渗透压的升高所导致，我们设置了甘露醇组（ｈｉｇｈｍａｍｉｉｔｏｌ，?ＨＭ??组，甘露醇浓度为２５?ｍｍｏｌ／１，作用时间为４８?ｈ），结果发现，甘露醇组与对照组??之间，ＮＲ２Ｅ１的表达水平差异无统计学意义（ｐ?＞０．０５）。这些结果提示，高浓度??葡萄糖可显著改变ＳＶ４０ＭＥＳ１３细胞中ＮＲ２Ｅ１的表达水平，并且这种改变不是??由高糖引起的渗透压升高导致的。（图１．３）??Ａ?Ｂ?Ｃ??０．６，?８－１??＊禽??￡?丁?＊＊?＜??｜?Ｈ｜?｜?６－
【参考文献】

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本文编号：2857657