PHD锌指蛋白14抑制肾间质纤维化的机制研究

发布时间：2020-10-27 06:34

　　 研究目的:本研究主要探讨PHD锌指蛋白(PHF)14受缺氧诱导因子(HIF)1α诱导以及PHF14在马兜铃酸诱导的肾间质纤维化中的抑制效应及机制。方法:1.利用前期构建PHF14条件敲除小鼠,实验组小鼠基因型为phf14 flox/flox Cre+,同龄基因型为phf14 flox/flox Cre-的小鼠为对照组。在8-12周龄时,予以他莫西芬连续5天腹腔注射敲除PHF14,确认实验组小鼠PHF14成功敲除后,马兜铃酸(3mg/kg体重)腹腔注射3周(每3天一次)诱导肾纤维化。6周后处死小鼠,留取肾组织行Masson染色及免疫组化检测型胶原(Col)、α平滑肌肌动蛋白(α-sma),用Western blot、Real time PCR分别检测PHF14、Col、α-sma、结缔组织生长因子(CTGF)表达,留血液标本检测肌酐、尿素氮。2.大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)予以HIF脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG刺激,使细胞内HIF-1α升高,另一组同时加入HIF-1α抑制剂KC7F2,抑制HIF-1α表达及入核,使用Western blot、Real time PCR检测不同时间点(0,1,3,6h)HIF-1α、PHF14和CTGF变化。3.在NRK-52E细胞中,利用染色质免疫共沉淀的方法,检测HIF-1α是否可分别结合在PHF14与CTGF启动子区域。4.利用siRNA技术干扰NRK-52E细胞中PHF14表达,给予DMOG升高细胞内HIF-1α,通过Western blot、Real time PCR检测CTGF表达。5.在NRK-52E细胞中,应用染色质免疫共沉淀的方法明确PHF14是否可结合在CTGF的启动子区域。结果:1.机体在遭受马兜铃酸的纤维化刺激后,敲除PHF14的小鼠纤维化指标Col、α-sma表达较对照组明显升高。相比野生型小鼠,敲除组小鼠的肌酐、尿素氮的指标明显升高。2.在细胞水平上,使用DMOG刺激细胞后,PHF14、CTGF的表达也升高,而抑制HIF-1α入核后,PHF14、CTGF的表达增加被抑制。通过染色质免疫共沉淀的方法证明了HIF-1α可结合在PHF14和CTGF的启动子区域。3.在细胞水平上干扰PHF14表达后,使用DMOG刺激后CTGF的表达明显升高,通过染色质免疫共沉淀的方法证明PHF14可结合在CTGF的启动子区域。结论:在马兜铃酸诱导的肾纤维化小鼠中,敲除PHF14的小鼠纤维化表型更重,肾功能损害更严重。通过细胞水平的研究发现,PHF14和CTGF都可以被HIF-1α诱导,在干扰PHF14表达后CTGF的表达增加,通过染色质免疫共沉淀的方法证明PHF14可结合在CTGF的启动子区域。PHF14通过调控CTGF表达抑制了HIF-1α促纤维化作用的过度激活,本研究进一步阐述了PHF14在抑制纤维化进展中的重要作用。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：

PHD 锌指蛋白 14 抑制肾间质纤维化中结 果一、PHF14 lox+/+ Cre+及 PHF14 lox+/+ Cre-基因及他莫西芬诱导敲除后 PHF14 的表达情况普通 PCR 的方法对小鼠的基因型进行鉴定，对筛选出来的小鼠在 莫西芬 3mg/40g 体重连续 5 天腹腔注射，在第 6 天时每组选取 1 脏行 western blot。通过 western blot 发现 PHF14 lox+/+ Cre+小鼠的下降,差别具有统计学差异。（图 1-1）

海军军医大学硕士学位论文time PCR、Masson 染色及免疫组化观察两组小鼠纤维化指标表达情况。通过 western blot 可以发现与对照组小鼠相比，PHF14 敲除小鼠的 Col 1、α-sma表达明显高于对照组，在 real time PCR 上可得到同样的结果。Masson 染色、免疫组化上可以见到 PHF14 敲除小鼠与对照组小鼠相比，其纤维化更重。

图 1-3 小鼠的肾脏标本 Masson 染色、Col 1、α-SMA 免疫组化结果由上图可见，与对照组小鼠相比，PHF14 敲除的小鼠在 Masson 染色上可见其纤维化明显更重，COL 1 和 α-SMA 的结果与 Western blot 和 real time PCR 一致，在 PHF14 敲除小鼠的肾组织中二者表达均较对照组明显升高。三、PHF14 敲除小鼠与对照组小鼠在马兜铃酸刺激后肾功能变化情况对予以马兜铃酸的小鼠处死时取全血，留取血清检测其尿素氮、肌酐的表达以体重进行校正后分析两组小鼠在肾功能上有无差异。通过对比发现，PHF14敲小鼠的肌酐、尿素氮上升更明显（图1-4）。说明 PHF14敲除小鼠在经受纤维化刺时，肾功能损害更为严重。
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本文编号：2858189