高糖培养HK-2细胞环状RNA表达谱变化及caspase-1抑制剂的干预研究

发布时间：2020-10-30 11:52

　　 目的:检测并验证体外正常糖、高糖、高糖+VX-765(caspase-1抑制剂)培养的HK-2细胞(人近端肾小管上皮细胞)circRNA差异表达谱,探索可能参与糖尿病肾病肾小管间质病变炎症及焦亡发病机制的circRNAs。方法:体外培养的HK-2细胞分为3组:正常糖组、高糖组,高糖+VX-765组,同步培养24小时后trizol提取总RNA。采用Arraystar Human circRNA Array V2芯片检测3组细胞circRNA的表达水平,Agilent Feature Extraction软件(版本11.0.1.1)分析采集的阵列图像,R软件limma软件包进行数据标准化处理。通过表达倍数变化(fold change2)确定3组细胞间差异表达的circRNAs,通过分层聚类区分3组细胞间circRNAs的表达模式,使用基于Target Scan和miRanda的miRNA靶标预测软件预测可能与circRNA相互作用的microRNA。最后根据表达倍数及表达量由大到小选择满足在高糖VS正常糖组上调,同时在高糖+VX-765 VS高糖组中下调及在高糖VS正常糖组下调,同时在高糖+VX-765 VS高糖组中上调的circRNAs各5个进行后续qRT-PCR验证及生物信息学分析。结合文献初步探讨可能参与糖尿病肾病肾小管间质病变炎症及焦亡发病机制中的circRNAs。结果:1.circRNA芯片结果显示高糖组与正常糖组相比,表达上调的circRNAs共92个,表达下调的circRNA共25个,其中上调最显著的是hsa_circRNA_402294(7.0299804倍),下调最显著的是hsa_circ RNA_001906(-22.9722809倍)。高糖+VX-765组与高糖组相比,表达上调的circRNA共有54个,表达下调的circRNA共有103个,其中上调最显著的是hsa_circRNA_404975(100.4332781倍),下调最显著的是hsa_circRNA_103142(-21.0658222倍)。2.caspase-1抑制剂(VX-765)可抑制54个circRNAs在高糖状态下的高表达、14个circRNAs在高糖状态下的低表达。这些circRNAs可能参与糖尿病肾小管间质的炎症及焦亡病变。3.hsa_circRNA_102747,hsa_circRNA_405650,hsa_circRNA_104854经qRT-PCR验证在三组细胞间差异具有统计学意义4.每个circRNA均有详细的注释信息,均有按照与其竞争结合强弱关系排序的5个microRNAs,可进行后续ceRNA机制分析或其他功能机制探讨。结论:本实验发现体外培养的HK-2细胞,高糖组与正常糖组相比circRNAs谱异常表达,高糖组中加入caspase-1抑制剂(VX-765)后circRNAs表达谱与高糖组相比又发生显著改变。circRNAs可能参与糖尿病肾病肾小管间质病变,可能与炎症及焦亡机制有关。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

用 Agilent G2505CG2505C 扫描杂交后的芯片，结果如图 1 所示，均匀、清晰，没有边缘化效应、刮伤等影响信号值，阳性定位点和区域明显，说明芯片结果可用。正常糖组 高糖组 高糖+VX-765图1 芯片扫描图过箱式图（Box Plot）分析，如图2所示。可以观察到三组样品cir密度值经过标准化后平均值接近在一个水平上，数据中间的50%范高，数据基本符合正态分布。

位对照区域明显，说明芯片结果可用。正常糖组 高糖组 高糖+VX-765 组图1 芯片扫描图通过箱式图（Box Plot）分析，如图2所示。可以观察到三组样品circRNA原始荧光密度值经过标准化后平均值接近在一个水平上，数据中间的50%范围值一致性较高，数据基本符合正态分布。图2 Box Plot-circRNA通过散点图（Scatter Plot）分析，如图3所示，可直观看到两组间芯片表达数据的分布变化，观察到两样品数据总体分布集中趋势。本实验选择circRNA的

Foldchange＞2.0。图3 Scatter Plot-cirRNA通过分层聚类分析，如图4所示，证实三组样品均为同类，可直观的看出三组细胞中同一circRNA相对表达量高低情况。红色代表相对高表达，绿色、蓝色代表相对低表达。图4 高糖组、正常糖组、高糖+VX-765组中差异circRNA的分层聚类热图
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本文编号：2862436