TLR2在糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮—间质转化中的作用

发布时间：2020-11-04 16:35

　　 目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最重要的并发症之一,也是造成慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)的主要病因,严重影响患者的生活质量及生存率,因此,探究DN发病机制尤为重要。肾小管间质纤维化(tubulointerstistisis fibrosis,TIF)是CKD的重要标志。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在TIF的进展中起中心作用。Toll样受体2(Toll like receptors 2,TLR2)是Toll样受体家族(Toll like receptors,TLRs)重要一员,参与多种肾脏疾病的发生发展,那么,TLR2是否参与DN肾小管EMT呢?因此,本研究以DN患者肾活检标本、人肾小管上皮细胞HK2及TLR2敲除小鼠糖尿病模型为研究对象,探究TLR2在DN肾小管EMT中的作用。方法:1.以DN患者肾穿组织、肾肿瘤瘤旁正常对照肾脏组织为研究对象,用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)技术检测TLR2、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及上皮型钙粘蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin)在肾组织中的表达水平,并分析TLR2与α-SMA、E-cadherin的相关性。2.探讨高糖能否引起HK2发生EMT及TLR2的激活:以HK2为研究对象,高糖(30 mM)培养0 h、24 h、48 h、72 h收集细胞,Western Blot检测TLR2、α-SMA及E-cadherin蛋白的表达。3.探讨TLR2是否参与了高糖诱导的HK2发生EMT及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的分泌:正常培养并处于良好生长状态HK2随机分为对照组(control)、高糖刺激组(High Glucose,HG)、高糖刺激+空载shRNA转染组(HG+shNC)、高糖刺激+shTLR2转染组(HG+shTLR2),Western Blot技术检测α-SMA及E-cadherin蛋白的表达;同时收集细胞培养上清液,运用ELISA技术检测HK2培养上清中TGF-β1蛋白的含量。4.探讨抑制TLR2的表达对DN小鼠肾小管EMT的影响:以C57BL/6J野生型和同背景的TLR2~(-/-)小鼠为研究对象,用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病模型。将小鼠分为control组、WT+STZ组、TLR2~(-/-)+STZ组。提取小鼠鼠尾DNA鉴定小鼠基因型;取部分肾皮质提取蛋白,Western Blot检测α-SMA及E-cadherin蛋白的表达。5.探讨抑制TLR2的表达对DN小鼠肾小管细胞外基质沉积的影响:取部分小鼠肾皮质制作冰冻切片,免疫荧光(Immunofluorescent,IF)检测纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达,部分肾组织制作石蜡切片,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)的表达;Masson染色技术检测肾间质纤维化。6.探讨抑制TLR2的表达对DN小鼠肾小管TGF-β1的影响:取小鼠肾组织石蜡切片,免疫组化检测TGF-β1的表达。结果:1.在DN时,肾小管上皮细胞TLR2高表达且与其EMT呈显著相关性:IHC结果显示:TLR2、α-SMA蛋白主要定位于肾小管上皮细胞胞质;E-cadherin主要定位于肾小管上皮细胞胞质和细胞膜。与control组相比,DN患者肾穿组织肾小管上皮细胞中TLR2、α-SMA蛋白表达明显上调,E-cadherin蛋白表达明显下调,TLR2与α-SMA表达呈明显正相关(P0.05,r=0.5188),TLR2与E-cadherin表达呈明显负相关(P0.05,r=﹣0.6625)。2.高糖可以引起肾小管上皮细胞HK2发生EMT及TLR2蛋白表达上调:Western Blot结果显示,与0 h相比,高糖刺激后,TLR2、α-SMA蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白表达水平下降。3.TLR2参与了高糖诱导的HK2发生EMT和TGF-β1的分泌:Western Blot结果显示:与HG+shNC组相比,HG+shTLR2组α-SMA表达下降,且E-cadherin表达上升;同样ELISA结果显示:HG组TGF-β1的分泌明显高于control组,而与HG+shNC组相比,敲低TLR2表达能够减低高糖诱导的TGF-β1的分泌。4.敲除TLR2基因能够改善糖尿病小鼠肾小管上皮细胞的EMT:PCR结果显示:TLR2~(-/-)小鼠鼠尾组织TLR2 wild-DNA呈阴性而TLR2mutant-DNA呈阳性。Western Blot结果显示:与control组相比,WT+STZ组α-SMA表达上升,且E-cadherin表达下降,表明小鼠肾小管上皮细胞发生了EMT;但与WT+STZ组相比,TLR2~(-/-)+STZ组α-SMA表达下降,E-cadherin表达上升。5.敲除TLR2基因能够抑制糖尿病鼠肾小管细胞外基质沉积:IF、IHC和Masson结果显示:与control组相比,WT+STZ组FN和CollagenⅢ表达上调且蓝染的胶原纤维增多;而TLR2~(-/-)+STZ组FN和CollagenⅢ表达下降且蓝染的胶原纤维减少。6.敲除TLR2基因能够减少糖尿病鼠肾小管细胞TGF-β1的表达:免疫组化结果显示:TGF-β1蛋白主要定位于肾小管上皮细胞胞质,与control组相比,WT+STZ组TGF-β1表达上升;但与WT+STZ组相比,TLR2~(-/-)+STZ组TGF-β1表达下降。结论:在DN发病过程中,TLR2表达上调,且可能通过增加TGF-β1的表达参与DN时肾小管上皮细胞EMT。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692.9;R587.2
【部分图文】：

20图 1A 免疫组化检测 DN 肾穿标本和对照组中 TLR2、α-SMA 和E-cadherin 蛋白的表达(Bar:50 μm)Fig.1AThe expression of TLR2, α-SMAand E-cadherin in renopuncturetissues of DN patients and control group. (Bar:50 μm)

stern Blot 检测各组细胞 α-SMA、E-cadhe Western Blot analysis of α-SMA，E-cadher(*P<0.05 vs oh group)TLR2 参与了高糖诱导的 HK2 发生 EMT Blot 结果显示，shTLR2 可以敲低 TLR2 蛋HG 组 α-SMA 表达明显升高，E-cadherin 达后，即 HG+shTLR2 组 α-SMA 表达下 3A)。ELISA 结果显示，与 control 组相比高，同时与 HG+shNC 组相比，HG+ shTLB)。

B ELISA 检测细胞培养上清中 TGF-β1 的ontents of TGF-β1 in the supernatant of cedetermined by ELISA.05 vs control group;#P<0.05 vs HG+shNCR2能够改善DN时肾小管上皮细胞的EM示：TLR2-/-小鼠鼠尾组织TLR2 wild-DN性(图4A)。Western Blot结果显示，与A表达上升，且E-cadherin表达下降，表MT；但与WT+STZ组相比，TLR2-/-+ST表达上升(图4B)。
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 王浩;顾劲扬;丁义涛;;上皮-间充质转化调控的分子机制研究进展[J];中华实验外科杂志;2014年01期

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本文编号：2870341