局灶节段性肾小球硬化相关基因变异的研究

发布时间：2020-11-10 21:51

　　 研究目的:局灶节段性肾小球硬化(FSGS)是与足细胞损伤相关的一种临床病理综合征。自从20世纪30年代初对这种临床病理现象的发现以来,各种研究揭示了有关FSGS的可能潜在的发病机制,包括:由于足细胞结构或功能固有的缺陷而引起的原发性FSGS;由体脂含量过高、病毒等外源物质、药物、循环因子等诱导的继发性FSGS;某些单基因突变所造成的与遗传因素相关的FSGS。然而FSGS的具体致病原因仍然是未知的,大量研究显示与足细胞相关的单基因的变异参与了FSGS的发病过程。我们课题组分别探索了NPHS1,COL4A5,APOL1三种足细胞相关基因,从生物信息学分析、临床个案报道以及对细胞形态和功能的影响等不同角度开展研究。期望检测出与FSGS相关的变异,并初步探讨其致病机制,以利于临床诊断和预后。研究方法:(1)收集既往文献中报道的关于NPHS1基因突变的信息,汇总后作为参考。从千人基因组数据库中筛选出包含2504名健康受试者的NPHS1突变信息作为正常对照。临床收集309名散发型FSGS患者,运用基于36种基因的Panel的二代测序和全外显子组测序的方法,进行NPHS1基因变异检测。在患者中统计出错义突变位点后,分别用三种软件进行致病性的预测。分析测序和预测的结果并结合nephrin蛋白结构绘制热点功能域图。(2)对1例有肾脏病家族史的肾活检证实为FSGS的患者,进行IV型胶原免疫组织化学染色,并提取外周血DNA进行全外显子测序,寻找可能的致病突变。(3)基于前期研究,构建定点突变位点的APOL1质粒,通过电穿孔方法将定点突变的质粒和购买的野生型质粒转染进生长状态良好的足细胞。48小时后在显微镜下观察比较突变型质粒对细胞形态的影响;利用Lipofectamine 3000脂质体方法将突变型和野生型质粒转染进293T细胞,通过膜片钳方法检测其对细胞膜上氯离子通道的影响。研究结果:(1)在309名散发型FSGS患者中共找到17个错义突变位点和1个剪切突变位点,其中有一个新的突变位点是在第19号外显子中的c.G2638T,同时第28号外显子中的35830957 CT剪接突变也是一个新的突变位点。通过软件预测共发现5个突变位点可能会导致FSGS的发生。大部分错义突变位点集中在nephrin蛋白Ig1,Ig3,Ig7和C-末端细胞跨膜区域。(2)患者的肾脏组织免疫组织化学染色结果显示,IV型胶原抗体染色结果COL4A5组表达低于正常对照组。全外显子测序结果发现COL4A5基因第20位氨基酸出现异常,显示为移码突变。综合诊断该名患者确诊为表现出FSGS激素敏感性的由COL4A5基因新突变所引起的Alport综合征的病例(3)APOL1基因会使足细胞发生溶解和破裂现象,新发现的突变会造成足细胞大面积的形态异常,甚至导致成团的聚集和死亡。同时,该基因会上调细胞膜氯离子通道的电流值,随着电压的升高,突变组对氯离子流动影响显著。研究结论:我们分别从三个足细胞相关的热点基因展开遗传学研究,从不同层面探讨基因突变对中国FSGS患者的影响。结果表明,NPHS1基因突变在我国FSGS患者中较为常见,但我国FSGS遗传背景与西方人有较大差异且存在多个突变位点与FSGS存在一定的相关性。新发现的COL4A5基因突变位点可能为Alport综合征的致病性遗传位点,建议临床将病理结果结合基因检查报告对复杂的病例进行综合性诊断,提高诊断精准度,避免不必要的激素用药。在我国患者中发现的APOL1基因的新突变会造成足细胞形态的损伤并可能破坏细胞氯离子通道,从而导致FSGS的发生。
【学位单位】：电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692
【部分图文】：

NPHsl基因错义突变在不同人群中的位点总结

是 Ig1 和跨膜结构域分别出现两个突变。这些突变区域与以往其他地区的报道显示既有重合也有不同之处，提示 NPHS1 基因在我国散发型 FSGS 患者中的突变与其他地区的情况有所不同。2.2.3 中国 FSGS 患者突变位点所在功能域分析我们针对本研究中所发现的17个错义突变，结合NPHS1基因外显子和nephrin蛋白功能域的对应关系，绘制出突变热点功能域图。虽然总体来说 NPHS1 基因突变位点在 nephrin 蛋白结构域中的分布情况仍然比较分散，这与我们前期总结出的突变结果相似，但是其中值得关注的是我们的研究结果显示 Ig3 和 Ig7 两个结构域发生致病性突变的概率相对集中且突变率较高。我们将找到的错义突变与 nephrin 蛋白功能域相对应绘制成如图 2-4 所示。我国 FSGS 患者突变主要集中在 Ig1，Ig3，Ig7 和 C-末端细胞跨膜区域，这与前期研究报道显示在 Ig1 和 Ig7 结构域中观察到多数 NPHS1 突变的情况一致。说明这些结构域可能为 NPHS1 基因突变的热点功能域。

第三章 COL4A5 基因新突变在继发性 FSGS 患者中的报道 7）12,000 rpm 条件下离心两分钟后弃废液。将吸附柱 CB3 室温条时间，使内壁上残余的 PW 挥发干净。8）将吸附柱转入提前灭菌离心管中，枪头位置控制在中部上空滴冲液 TE，室温放置数分钟。9）12,000 rpm 条件下离心两分钟，将溶液收集到离心管中备用。果家系调查 3-2 所示，先证者过去没有明显病史，其母亲于先证者发病时间毒症逝世，其外婆去世病因不详。
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 彭婷;李贵森;;载脂蛋白L1基因突变及其相关疾病的研究进展[J];中华肾脏病杂志;2016年05期

本文编号：2878377