CXCR3在高糖诱导足细胞凋亡中的作用和机制研究

发布时间：2020-11-11 02:13

　　 目的:糖尿病肾病(DN)是一种严重的糖尿病微血管并发症。肾脏活检数据分析显示,糖尿病患者肾脏损害包括上皮细胞和支持细胞功能障碍。足细胞作为终末分化细胞,是肾小球重要的功能细胞,一旦损伤,不能再生。足细胞损伤和凋亡会导致肾小球滤过膜的功能障碍,并成为诱导DN发生的不利因素。CXCR3为趋化因子CXCL9/CXCL10/CXCL11的共同受体,与炎症反应密切相关。CXCR3分布于多种免疫细胞的表面,如自然杀伤细胞(natural killer cell),类浆样细胞(plasmacytoid cells)、树突细胞(dendritic cell),特别是活化的T细胞。DN的发生与足细胞凋亡增加、增殖减少有关,而足细胞凋亡与这些炎性细胞及其产生的细胞因子密切相关。因此,高糖环境下足细胞CXCR3表达及其与凋亡、炎症反应间的关系值得研究。为此,我们观察了不同葡萄糖浓度下体外培养足细胞的增殖活性以及CXCR3在足细胞中的表达情况,研究CXCR3对体外培养足细胞凋亡的影响;进一步探讨了CXCR3对足细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达以及足细胞足突间裂空隔膜(SD)组分蛋白podocin、nephrin的影响,探讨CXCR3与活性氧(ROS)以及TNF-a、IL-6、IL-1β等炎症因子表达的关系,明确CXCR3在DN发生发展中的作用。方法:首先,体外培养小鼠足细胞,待其分化成熟后分五组,分别在5.5mM、15mM、25mM、35mM、50mM葡萄糖浓度下培养。使用MTT比色法检测细胞增殖活性,使用Quantitative real-time PCR(Q-rtPCR)检测足细胞CXCR3mRNA、Western blots(WB)检测CXCR3蛋白表达。其次,将体外培养分化成熟的足细胞分为四组:模型组(30Mm葡萄糖);干扰组(30Mm葡萄糖+CXCR3siRNA);空载体组(30Mm葡萄糖+空载体);正常对照组(5.5Mm葡萄糖),分别于12h、24h、48h、72h用CCK-8试剂盒测细胞活性,使用Q-rtPCR检测CXCR3mRNA、WB检测CXCR3蛋白表达,应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,使用JC-1荧光探针检测线粒体跨膜电位(ΔΨM),使用二氯二乙酸酯(DCFH-DA)测量ROS含量,使用ELISA检测TNF-a、IL-6、IL-1β含量,使用WB检测podocin、nephrin、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白含量。结果:体外培养小鼠足细胞的活性随葡萄糖浓度的增加而降低,且呈剂量和时间依赖性;同时,CXCR3mRNA及CXCR3蛋白的表达随葡萄糖浓度的增加而增加,且呈剂量和时间依赖性。模型组足细胞活性低于正常组,CXCR3mRNA及CXCR3蛋白含量高于正常组,线粒体跨膜电位ΔΨM低于正常组,细胞凋亡率明显高于正常组,细胞周期阻滞在S期及G2/M期;模型组足细胞ROS、TNF-a、IL-6、IL-1β含量明显高于正常组;模型组足细胞SD组分蛋白podocin、nephrin显著低于正常组,凋亡蛋白Bax、caspase-3高于正常组,抗凋亡蛋白Bcl-2低于正常组。CXCR3siRNA提高了高糖环境下足细胞的活性与ΔΨM,降低了细胞凋亡与ROS、TNF-a、IL-6、IL-1β水平,提高了podocin、nephrin、Bcl-2蛋白表达,降低了Bax、Caspase-3表达。结论:高糖提高了小鼠足细胞CXCR3表达,降低了足细胞增殖活性、引起细胞周期阻滞与细胞凋亡,提高了ROS及炎症因子水平,降低了SD组分蛋白表达;抑制CXCR3表达可增强足细胞增殖活性,减少细胞凋亡与ROS、炎症因子水平,提高SD组分蛋白表达。CXCR3在足细胞凋亡中可能起重要作用,与诱导ROS与炎症反应有关。可见,CXCR3可能是DN的一个潜在治疗靶点。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

1 足细胞在不同糖浓度下细胞活性的变化（Mean±SD,n=3）。图中数据对于 5.5 mM 糖作用下的比值。2 不同浓度葡萄糖对足细胞 CXCR3 mRNA 表达的影响（Mean±SD,n=3与 5.5 mM 葡萄糖作用组相比，P<0.01。

不同浓度葡萄糖对足细胞CXCR3mRNA表达的影响（Mean±SD,n=3）.**与5.5mM葡萄糖作用组相比，P<0.01

图 1.3 不同浓度葡萄糖对足细胞 CXCR3 蛋白表达的影响（Mean±SD,n=3）. ** 与5.5 mM 葡萄糖作用组相比，P<0.01。1.3 讨论糖尿病肾病（DN），为终末期肾功能衰竭的主要原因之一，是糖尿病患者最严重的并发症之一，1 型或 2 型糖尿病患者有 30%–40%可发展为 DN[2]。DN 的早期症状是尿蛋白增多，以肾小球系膜结节样增生和肾小球基底膜增厚为特征。微量白蛋白尿在肾小球基底膜的变化中起重要作用。此外，详细的肾脏活检数据分析显示糖尿病患者肾脏损害包括内脏上皮细胞和支持细胞功能障碍[3, 4]。许多研究表明糖尿病肾病足细胞损伤是多因素共同导致的，包括机械应力，炎症反应、氧化应激、TGF-β1 诱导，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的激活，和 AGEs 的积累。并且有许多信号通路包含在由自噬介导的调节 mTOR 信号通路，腺苷单磷酸激酶（AMPK）信号通路，Wnt 信号通路，β-catenin 信号通路等。该相关的机制尚不完全清楚，有待进一步研究。AMPK 不仅是一种在糖尿病进
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本文编号：2878606