下丘脑室旁核WNT-RAS信号通路对肾脏纤维化调控作用的研究

发布时间：2020-11-16 18:42

　　 研究背景:随着我国经济建设的快速发展,健康问题也受到越来越多的关注,而慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)就是其中一个深受关注的焦点。研究显示慢性肾脏疾病的发病率逐年升高,而有效的治疗手段却相当匮乏。这一现状不仅极大的加重了社会及家庭的经济负担,同时也严重的影响了患者的生活品质。研究并解决这一现状已然成为一个极其迫切的现实问题。研究证实Wnt/β-catenin信号通路和肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)均在肾脏纤维化疾病中起着至关重要的作用。同时有研究表明RAS组份中的各种信号分子均受到了 Wnt/β-catenin信号通路的直接调控,如血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT),血管紧张素转化酶1(Angiotensin converting enzyme,ACE-1),血管紧张素 Ⅱ(AngⅡ),血管紧张素Ⅱ的1型受体(AngiotensinⅡ AT1-receptor,AT1R)。在早期的研究中证实,不仅是肾脏局部及循环中的RAS成分对肾脏纤维化的发生和发展起着重要的作用,中枢神经系统(如下丘脑室旁核,PVN)的RAS也参与了这一过程,并且肾脏局部和中枢神经系统之间信号调节和反馈机制的研究也取得了积极的进展。但是PVN的wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化疾病中可能起到的作用、PVN的wnt/β-catenin信号通路和PVN的RAS是否存在某种关联、PVN的wnt/β-catenin信号通路对肾脏局部的wnt/β-catenin信号通路和RAS是否存在关联等问题都尚未被阐明。目的:通过阻断PVN的Wnt/β-catenin信号通路来探究PVN的wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化疾病中可能起到的作用、PVN的wnt/β-catenin信号通路和PVN的RAS之间可能存在的关联、PVN的WNT-RAS信号通路和肾脏局部的WNT-RAS可能存在关联等。方法:1、选择雄性Sprague Dawley(SD)大鼠进行5/6肾切除术(5/6NX),建立肾脏纤维化疾病模型。于造模后第6周称量大鼠体重,用尾套法测量大鼠血压,通过剪尾法采集血液并测量血肌酐、尿素氮,使用代谢笼收集24h尿液并检测24h蛋白尿。根据检测结果筛选成模大鼠,进行随机化分组并通过侧脑室注射AAV过表达载体阻断PVN的Wnt/β-catenin信号通路。2、干预持续6周时间,处死前测量血压,称量体重,收集24h尿液,之后牺牲并采集血液、脑组织及肾脏组织样本待检。3、通过western blot和免疫组化方法检测中枢PVN及肾脏的wnt/β-catenin信号通路和RAS的活化程度。通过western blot及HE,PAS染色评估肾脏纤维化及肾小球硬化损伤程度。结果:1、天狼猩红和PAS染色结果显示,5/6NX大鼠和对照组相比出现了明显的肾脏纤维化及肾小球硬化等病变。2、免疫组化及 western blot 结果显示,肾脏及 PVN 的 wnt3a、active-β-catenin、AGT、ACE-1、AT1表达水平均显著上调,提示肾脏和脑内的wnt/β-catenin信号通路及RAS均显著活化。3、免疫组化及western blot结果显示,经侧脑室注射含有目的基因DKK1的AAV过表达载体后肾脏及PVN的wnt/β-catenin信号通路及RAS组分包括wnt3a、active-β-catenin、AGT、ACE-1、AT1表达水平均被显著抑制,且肾脏纤维化等病理改变显著改善。结论:1.肾脏纤维化改变不仅和肾内WNT-RAS的异常活化相关,同时还受中枢WNT-RAS的调控。2.在肾脏纤维疾病中脑内wnt/β-catenin信号通路调控了 RAS的表达,同时肾脏局部的WNT-RAS信号通路受到脑内WNT-RAS信号通路的密切调控。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692
【部分图文】：

同时免疫荧光共定位结果显示ＤＫＫ１阳性细胞和ＧＦＰ阳性细胞之间有??良好的相关性，这些结果都证实了?ＡＡＶ－ＤＫＫ１过表达载体在大鼠ＰＶＮ中成功过表??达（如图１－１所示）。??ＧＦＰ?ＤＫＫ１?Ｍｅｒｇｅ?Ｍａｇｎｉｆｙ??ｉｃｖａｃｓＦ??图１－１．?ＡＡＶ－ＤＫＫｌ过表达载体在ＰＶＮ中成功过表达。实验中使用了特异性抗体ＧＦＰ?（绿??色）和ＤＫＫ１?（红色）对ＰＶＮ组织进行免疫荧光共染，白色箭头指示的是ＧＦＰ和ＤＫＫ１共染呈??阳性的细胞（黄色）。放大倍数Ｘ?１００；比例尺＝２００?ｕｎｉ。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－］：?Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ?ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ?ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?ＤＫＫ１?ｉｎ?ＰＶＮ．??Ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＧＦＰ?ａｎｄ?ＤＫＫ１?ｉｎ?ＰＶＮ?ｗａｓ?ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ?ｂｙ?ｄｏｕｂｌｅ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｏｆ??ａｇａｉｎｓｔ?ＧＦＰ?（ｇｒｅｅｎ）?ａｎｄ?ＤＫＫ１?（ｒｅｄ）．?Ｔｈｅ?ｗｈｉｔｅ?ａｒｒｏｗ?ｉｎｄｉｃａｔｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｅｌｌｓ?ｗｉｔｈ?ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ??ｏｆ?ＧＦＰ?ａｎｄ?ＤＫＫ１?（ｙｅｌｌｏｗ）．?Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｘ?１００；?ｓｃａｌｅ?ｂａｒ?＝２００｜．ｉｍ．??２．２?ＰＶＮ的ｆｆｎｔ／Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路在５／６ＮＸ大鼠中显著活化

ｃａｔｅｎｉｎ的表达水平显著升高，这也预示着ＰＶＮ的Ｗｎｔ／?０?－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路与??肾脏纤维化病变密切相关。同时，侧脑室注射ＡＡＶ－ＤＫＫ１可以显著的抑制Ｗｎｔ／Ｐ－??ｃａｔｅｎｉｎ信号通路的异常活化（如图１－２所示）。??Ａ?ＩＣＶａＣＳＦ?ＩＣＶ?０ＫＫ１?ｎ??Ｍ?Ｓｈａｍ?＋５／６ＮＸ?＋５／６ＮＸ?°?°?ｗ１ｆ３ａ??ｔａｏ－ｉ?Ｅ３３?ａｏｌｒｖ＾?－ｃｓ＾ｒａｎ??！?＊??ｗｎｔ３ａ?．?｜?１００－?＊?參??ｒ??ａｃｔｉｖｅ－３?＊?．?广?＋?＋??？ｃａｔｅｎｍ?＂?＾?＾??ｒ?ｎ?＾??ＩＣＶａＣＳＦ?ＩＣＶ０ＫＫ１?ｆ?ｐ＾７３??Ｓｈａｍ?４－５／６ＮＸ?＾／６ＮＸ?？０Ｊ＇????＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿?＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿?＊〇?Ｑ?ｗＸｗ－；??ｗｗ?＾?！ｉ?ｏｅ－?ｍ?？??ａｃ，，ｖｅ＾??－ｍ?－?ｆ?０４＇?丁??—?ｊｉ?〇，＾?ｍ??ｅ．ａｔｔｉｎ?ｆ?〇Ｊｋｍｄ?？?＾??Ｅ．二．一一一＃ａ?ｙ?ｙ??图１－２．?ＰＶＮ的Ｗｎｔ／?Ｐ?－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路在５／６ＮＸ大鼠中显著活化

ＡＣＥ－１、ＡＴＩ表达水平显著升高。同时，通过侧脑室注射ＡＡＶ－ＤＤＫ１阻断ＰＶＮ的??ｗｎｔ／Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路可以显著的抑制ＰＶＮ的ＲＡＳ活性，这一结果提示ＰＶＮ??的ｗｎｔ／?Ｐ?－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路对ＰＶＮ的ＲＳＡ存在紧密的调控作用（如图１－３所。??ＩＣＶ?ａＣＳＦ?ＩＣＶ?ＤＫＫ１??Ｓｈａｍ?＋５／６ＮＸ?＋５／６ＮＸ??Ａ?Ｂ??ＡＧＴ?ｍ?ＡＧＴ??１５０－?￡２３?ＡＣ￡??｜?〇?ＡＴＩ??．？？？￣?ｕ??－?Ｉ?１００－?＾?＊??ｌ１?ｉｉ??ＡＴＩ?＞？?＃??ＩＣＶ?ａＣＳＦ?ＩＣＶ?ＤＫＫ１??Ｓｈａｍ?＋５／６ＮＸ?＋５／６ＮＸ??Ｃ?Ｄ?１?ａ?ａｇｔ??勺？?￡２３?ＡＴＩ??ｉｓ?．?ｉ?ｉ??．．．?ｉｔ?－而?６義?ｉｌ??—＿＿丨＿丨丨丨丨酬釀＞?｜＜?ｍｉ?Ｈｉ?ｍ??Ｐ－ｄｃｔｉｎ?１?＿Ｎ＿ＭＭＭＭＲＭＭＨＭＨＭＭＲＭＮｉＨＲＲＭＲＨＨＨｌＮＮＨＨＭＨＲＰ；?＾?＾??图１－３．?ＰＶＮ的ＲＡＳ表达水平在５／６ＮＸ大鼠中显著上调，侧脑室注射ＡＡＶ－ＤＫＫｌ可以显著地??抑制这一改变。（Ａ）免疫组化检测ＡＧＴ，?ＡＣＥ－１和ＡＴＩ在ＰＶＮ的表达水平。放大倍数Ｘ?１００；??比例尺＝２００?ｕｍ。（Ｂ）免疫组化的统计结果的柱状图。（Ｃ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测ＡＧＴ和ＡＴ１在??ＰＶＮ的表达水平。（Ｄ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ统计结果的柱状图。每组中ｎ＝４／５，?＊Ｐ＜０．?０５?ｉ，ｓ?ｓｈａｍ??组
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本文编号：2886531