研究背景:肾脏纤维化是各种原因引起的慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)发展至终末期肾病(end stage of renal disease,ESRD)的共同通路。无论基础疾病如何,慢性肾病一旦进展,启动纤维化过程造成细胞外基质大量堆积,肾组织广泛性疤痕形成,终将导致肾实质细胞毁损和终末期肾功能衰竭,延缓并改善肾脏纤维化对于慢性肾病的治疗有着十分重要的意义。肾脏纤维化的主要病理特征表现为肾间质纤维化及肾小球硬化,其病理进程复杂,多种信号通路和细胞因子参与其中,成纤维细胞的活化、炎症细胞的浸润和炎症因子的分泌、上皮细胞间质转化等,均可造成肾间质细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度堆积,促进肾脏纤维化的发生和发展。尽管大量有关肾脏纤维化的研究已取得重要进展,有效缓解和治疗肾脏纤维化的方法仍然少之又少。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)是目前已知最大的跨膜受体超家族,超过百分之三十的上市药物以此为靶点。β-Arrestins是GPCR最主要的负调控因子,不仅可以介导G蛋白偶联受体的脱敏、内吞和再循环,还可以单独作为支架蛋白调节下游信号通路,并且有研究证发现β-arrestins参与到多种纤维化相关信号转导,如Hedgehog、Notch以及TGF-β等信号通路,有待成为新的药物治疗靶点。Arrestin 家族由四个成员构成,Arrestinl(visual arrestin)和 Arrestin4(cone arrestin)主要分布于视网膜的视杆细胞和视锥细胞中,负责调控光受体的信号转导;Arrestin2(β-arrestin-1)和 Arrestin3(β-arrestin-2)共享 78%的氨基酸序列,广泛分布于哺乳动物的各个组织和器官中,对多种疾病的发生发展起到重要的调节作用。β-Arrestins偏向性配体与GPCR结合后,促使β-arrestins从胞浆中快速转移到细胞膜上,抑制G蛋白α亚基与βY亚基解离,进而终止GPCR下游信号通路。近年来研究发现β-arrestins也可单独作为支架蛋白,募集胞内蛋白分子调控复杂的信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB等。我们实验室前期的研究发现,β-arrestin-1和β-arrestin-2在糖尿病肾病小鼠模型以及人的组织切片中表达升高,并通过抑制ATG12-ATG5结合负调控足细胞自噬,从而加重肾脏损伤,但β-arrestins在肾脏纤维化发生发展中的作用尚不清楚。因此,本实验致力于研究β-arrestins在肾脏纤维化进程中的作用及机制。首次发现β-arrestin-1在肾间质纤维化肾皮质中表达升高,敲除β-arrestin-1可以抑制成纤维细胞活化、炎症浸润以及上皮细胞间质转化,改善肾脏纤维化,并通过体外细胞实验探究其具体分子机制。研究目的:1.检测β-arrestins在肾脏纤维化中的表达变化,明确β-arrestin-1是否参与肾脏纤维化的发生发展。2.探讨β-arrestin-1在肾脏纤维化发展进程中的作用及机制。3.研究β-arrestin-1是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与肾脏纤维化的发病过程。研究方法:第一部分:β-Arrestin-1促进肾脏纤维化的发生和发展1.β-Arrestins 在小鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型中的表征研究:选取32只6-8周野生型雄性C57BL/6J小鼠,随机分成4组,结扎左侧输尿管造成尿路梗阻,模拟肾脏纤维化过程,于造模3、7、14天后进行组织取材。利用Real-time RT-PCR、蛋白质免疫印迹法(Western-blot,WB)和免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC)的方法,检测 β-arrestin-1 和 β-arrestin-2在UUO小鼠肾皮质中的表达情况。进一步采用免疫荧光双标的方法,用不同节段的肾小管Marker与β-arrestin-1进行双染,对β-arrestin-1在肾脏中的表达进行定位。2.肾脏纤维化患者肾组织活检标本研究:山东大学基础医学院病理学教研室提供患者肾组织石蜡切片,选择出现典型肾脏纤维化的病理标本,包括输尿管梗阻性肾病、多囊肾病、糖尿病肾病患者的肾组织切片,与正常肾组织切片同时进行免疫组化染色,观察不同病理类型的肾脏纤维化肾组织中β-arrestin-1的表达情况。3.β-Arrestin-1 敲基因(β-arrestin-1-/-)小鼠 UUO 造模研究:选取18只雄性野生型C57BL/6J小鼠和18只雄性β-arrestin-1-/-小鼠,各分两组,随机选一组进行UUO造模,14天后进行组织取材。分别用PAS(Periodic Acid-Schiff)、MASSON和天狼猩红染色的方法,评估各组小鼠肾间质纤维化程度。用Real-time RT-PCR、WB和免疫组化的方法,检测纤维化标志性蛋白,包括胶原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)、α-SMA和fibronectin的表达变化。采用免疫荧光的方法观察肾皮质炎症细胞浸润情况,并用Real-time RT-PCR法检测炎症因子,如TGF-β1、IL-1β、IL-6的表达变化。采用免疫荧光双标的方法,观察小鼠肾脏EMT程度,并用WB法检测上皮细胞蛋白E-cadherin的表达变化。为进一步研究β-arrestin-1的作用机制,用Real-time RT-PCR法检测Wntl、Wnt2b、Wnt3、Wnt4等各型Wnt分子的表达变化,并用WB法观察Wnt下游信号分子β-catenin的活化水平。第二部分:β-Arrrestin-1在成纤维细胞和肾小管上皮细胞中的作用及机制1.β-Arrestin-1对成纤维细胞活化的调节作用:体外培养大鼠正常肾成纤维细胞(normal rat kidney fibroblast cells,NRK-49F cells),加入浓度梯度的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激细胞,用 Real-time RT-PCR 和 WB 的方法检测β-arrestin-1 的表变化。构建 β-arrestin-1 小干扰 RNA(Small interfering RNA,siRNA),转染NRK-49F细胞,WB检测β-arrestin-1的沉默效率。沉默NRK-49F细胞中β-arrestin-1的表达后加入TGF-β1刺激,用WB的方法检测collagenI、α-SMA和fibronectin的表达变化。2.β-Arrestin-1对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用:体外培养NRK-49F细胞,使用siRNA沉默β-arrestin-1的表达,加入TGF-β1刺激后,WB法检测Wntl和active-β-catenin的表达变化。构建含Wntl干扰序列的siRNA,转染NRK-49F细胞,Real-time PCR法检测Wntl的沉默效率。在TGF-β1刺激下,比较沉默Wntl和加入Wnt/β-catenin抑制剂Dkk1,对active-β-catenin、α-SMA和fibronecitn表达量的影响。在TGF-β1刺激下沉默 β-arrestin-1 后再加入 Wnt/β-catenin 激动剂 SKL2001,WB 检测active-β-catenin、α-SMA 和 fibronecitn 的表达变化。3.β-Arrestin-1对肾小管上皮细胞EMT的调节作用及机制:体外培养人肾小管上皮细胞(Human renal βroximal tubular cells,HK-2 cells),加入浓度梯度的TGF-β1刺激细胞,WB法观察β-arrestin-1的表达变化。用siRNA干扰HK-2细胞中β-arrestin-1的表达,WB法检测沉默效率。在HK-2细胞中,沉默β-arrestin-1后加入TGF-β1刺激,WB观察EMT相关蛋白的表达变化,包括E-cadherin、vimentin、slug和α-SMA,以及Wnt通路相关蛋白的表达变化,包括Wntl和active-β-catenin。实验结果:第一部分:β-Arrestin-1促进肾脏纤维化的发生和发展1.UUO小鼠肾皮质β-arrestin-1表达升高并定位在近曲小管:对C57BL/6J小鼠进行UUO造模,用Real-time RT-PCR和WB的方法检测β-arrestins的表达变化,结果发现UUO模型组肾皮质β-arrestin-1的表达量显著上调,在14天时最明显,而β-arrestin-2的表达变化不明显,免疫组化染色可见相同结果。用免疫荧光双标的方法,将不同节段肾小管Marker(红)与β-arrestin-1(绿)进行双染,荧光显微镜下可见β-arrestin-1的表达上调主要定位在近曲小管。2.肾脏纤维化病人肾活检组织中β-arrestin-1的表达升高:免疫组化结果显示,相比正常肾组织切片,输尿管梗阻性肾病、多囊肾、糖尿病肾病等出现典型肾脏纤维化病变的患者的肾组织切片中,β-arrestin-1表达量明显上调。3.敲除β-arrestin-1对肾脏纤维化损伤具有保护作用:β-Arrestin-1-/-小鼠肾脏纤维化程度减轻:PAS、MASSON和天狼猩红染色实验显示,β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组肾脏纤维化程度较野生型小鼠UUO模型组明显降低,表现为肾小管上皮细胞损伤减轻,间质胶原纤维染色颜色淡、范围小。采用Real-time RT-PCR、WB和免疫组化的方法,检测发现β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组,纤维化相关蛋白,包括collagenI、α-SMA和fibronectin的表达明显降低。β-Arrestin-1-/-小鼠炎症反应减轻:Real-time RT-PCR法检测发现,β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组,炎症因子包括TGF-1、IL-1β和IL-6的表达量明显下调。进一步利用免疫荧光的方法,发现β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组巨噬细胞浸润减少,而中性粒细胞浸润无明显变化。β-Arrestin-1-/-小鼠EMT程度降低:用近曲小管上皮细胞Marker AQP1与E-cadherin、α-SMA分别进行免疫荧光双标实验,结果显示β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组,EMT程度减轻,表现为E-cadherin表达明显恢复,α-SMA阳性成纤维细胞显著减少。WB结果同样证明β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组E-cadherin的蛋白表达量有明显恢复。β-Arrestin-1-/-小鼠 Wnt1/β-catenin 通路被抑制:寻找下游通路发现,β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组,Wntl表达量明显降低,但Wnt2b、Wnt3和Wnt4无明显改变。为了检测Wntl表达降低的生物效能,我们用WB的方法检测β-catenin的活化程度,结果显示β-arrestin-1-/-小鼠UUO模型组较野生型小鼠UUO模型组β-catenin的活化程度显著降低。因此我们推测β-arrestin-1通过激活Wntl/β-catenin信号通路促进肾脏纤维化发展。第二部分:β-Arrrestin-1在成纤维细胞和肾小管上皮细胞中的作用及机制1.β-Arrestin-1可促进成纤维细胞的活化:体外培养NRK-49F细胞,加入浓度梯度TGF-β1刺激24小时后,Real-time RT-PCR和WB法检测发现β-arrestin-1表达量出现显著上调。WB法检测发现,NRK-49F细胞在TGF-β1刺激下,沉默β-arrestin-1可以降低纤维化相关蛋白collagenI、α-SMA 和 fibronectin 的表达水平。2.β-Arrestin-1 对 Wnt/β-catenin 通路的调控作用:为了进一步寻找β-arrestin-1对成纤维细胞活化过程的调控机制,WB法检测发现沉默NRK-49F细胞中的β-arrestin-1,可以降低TGF-β1诱导的Wntl高表达和β-catenin的活化增强。对比沉默Wntl和使用Wnt/β-catenin通路抑制剂Dkk1对成纤维细胞的作用,WB结果发现二者均可抑制TGF-β1诱导的active-β-catenin、α-SMA 和 fibronectin 高表达,证明 β-arrestin-1 通过调节 Wntl的表达介导下游信号通路。WB实验发现,在TGF-β1刺激下,沉默β-arrestin-1后,加入 Wnt/β-catenin 激动剂(SKL2001)可以使 active-β-catenin 表达恢复,纤维相关蛋白α-SMA和fibronectin的表达升高。以上结果证明β-arrestin-1可以通过激活Wntl/β-catenin信号通路,促进肾脏成纤维细胞的活化。3.肾小管上皮细胞中β-arrestin-1对EMT的调节作用及机制:体外培养HK-2细胞,加入TGF-β1刺激后可使β-arrestin-1的蛋白表达水平和mRNA表达水平出现显著上调。使用siRNA沉默β-arrestin-1的表达,WB检测发现在TGF-β1刺激下,沉默β-arrestin-1可使E-cadherin表达恢复,并抑制vimentin、slug和α-SMA的表达。进一步实验证明,沉默β-arrestin-1可以抑制TGF-β1诱导的Wntl高表达和β-catenin的活化。结论及创新性:1.本实验首次发现β-arrestin-1在肾脏纤维化发生发展中起到重要的作用。肾脏纤维化模型中β-arrestin-1显著上调,沉默β-arrestin-1可抑制成纤维细胞活化,减少EMT,降低炎症反应。2.从机制上,体内和体外实验,均证明β-arrestin-1可上调Wntl表达和β-catenin的活化水平,进而促进成纤维细胞活化和上皮细胞间质转化。3.干扰β-arrestin-1可通过抑制Wntl/β-catenin通路,明显改善肾脏纤维化肾损伤,为治疗慢性肾病肾脏纤维化提供了新的靶点。
【学位单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2018
【中图分类】:R692
【部分图文】: p-arrestin-1?(绿)和不同节段肾小管Marker?(红),包括近曲小管(AQP1)、??远曲小管(CalbindinD28k)和集合管(AQP3),进行免疫荧光共定位。结果??如图1.2所示?.在UU07d模型组肾皮质中,p-arrestin-1表达升高并且与AQP1??表达出现共定位,证明在小鼠UUO模型中卩-arrestin-l的表达升高主要定位??在肾脏近曲小管。??3?Sham?UUQ7d?Sham?UU07d?Sham?UUQ7d??■H??■■■■■I??■?■?■??iWiWBB??图1.2?UUO模型中p-arrestin-1的表达定位??a:免疫荧光双标的方法检测P-arrestin-1在肾脏中的表达部位,结果显示:??P-arrestin-1和AQP1的表达出现共定位,证明在小鼠UUO模型组卩-arrestin-l的??表达升高主要定位在肾脏近曲小管。n=8。??二、肾脏纤维化患者肾活检标本研究??为了进一步验证P-arrestm-1在肾脏纤维化患者肾组织中的表达情况,我??们选取出现典型肾脏纤维化病变的人肾组织切片,包括糖尿病肾病、多囊肾??病和输尿管梗阻性肾病,和正常人肾组织切片,共同进行免疫组化染色。免??疫组化结果(图2)显示,阴性对照组(一抗PBS)无黄染,相比正常对照组,??44??
们选取出现典型肾脏纤维化病变的人肾组织切片,包括糖尿病肾病、多囊肾??病和输尿管梗阻性肾病,和正常人肾组织切片,共同进行免疫组化染色。免??疫组化结果(图2)显示,阴性对照组(一抗PBS)无黄染,相比正常对照组,??44??
、P-Arrestin-1在大鼠肾成纤维细胞中的作用??(―)TGF-pl刺激下NRK-49F细胞内p-ai-restin-1的表达变化??通过Real-time?RT-PCR?(图1.1a)和WB?(图1.1b)的方法,检测TGF-pl??刺激24h下,NRK-49F细胞中p-arrestin-丨的表达变化。结果显示,在TGF-[31??刺激下,P-arrestin-lmRNA水平和蛋白水平表达均明显升高,并且呈浓度依??赖性,在10ng/ml和15ng/nir浓度下升高最明显,因此后续实验用终浓度为???10ng/m?丨的?TGF-(31?刺激?NRK-49F?细胞。??a?b??????P-arrestin-1-^??N—iMp[ ̄5QKD??37KD??§?4l?*?〇?5?10?15????T?^?TGF-P1?24h(ng/ml)??I!3'?上__??iljiill?If?ill??^?T???H?>^1'B?B?S?B??TGF-P1?24h(ng/ml)??岳?〇??〇j?0__5__l〇_?15,??^?TGF-p1?24h(ng/ml)??图1.1?TGF-p丨刺激下NRK-49F细胞内p-arrestin-1的表达变化??a:?Real-time?RT-PCR法检测,在TGF-p丨刺激下,NRK-49F细胞屮p-an.estin-1??的表达变化。b:?WB检测TGF-pi刺激下,NRK-49F细胞中p-a「restin-l的表??达变化。*表示与空白对照组相比
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 吕林莉;刘必成;;国际肾脏纤维化研讨会[J];国际学术动态;2014年01期
2 麻志恒;钟利平;余柯娜;何立群;;何立群教授运用抗纤灵治疗慢性肾脏纤维化的经验[J];中国中西医结合肾病杂志;2015年05期
3 许科;张犁;;大黄酸抗肾脏纤维化研究进展[J];新中医;2012年05期
4 王波;戴小华;;干预CTGF在防治高血压早期肾损害肾脏纤维化中的价值[J];安徽医药;2011年05期
5 李晓忠;;肾脏纤维化能逆转吗?[J];实用儿科临床杂志;2011年17期
6 黄清河;郭汉城;;松弛素与肾脏纤维化的研究进展[J];医学综述;2010年07期
7 张明华;樊均明;;miRNA在肾脏纤维化中的研究进展[J];中国中西医结合肾病杂志;2009年09期
8 王伟铭;陈永熙;陈楠;;慢性肾脏病与肾脏纤维化和炎症[J];内科理论与实践;2007年06期
9 张军;肾脏纤维化的研究进展[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);2002年06期
10 邹朝霞;李均;;内质网应激与肾脏纤维化[J];海南医学;2017年04期
相关博士学位论文 前10条
1 许卉妍;β-Arrestin-1在肾脏纤维化发生发展过程中的作用及机制研究[D];山东大学;2018年
2 尹莎莎;TGFβ诱导miRNA及DNA甲基转移酶异常抑制Klotho促进肾脏纤维化表观遗传机制[D];南京大学;2017年
3 肖红波;热休克蛋白47在肾脏纤维化中的作用及机制研究[D];中南大学;2010年
4 宋锴;硫化氢在肾脏纤维化中的作用及其机制研究[D];苏州大学;2013年
5 魏明刚;益肾清利、和络汇浊法抗肾脏纤维化的机制与治疗2-3期慢性肾脏病的临床疗效评价[D];南京中医药大学;2009年
6 盖志博;Trps1表达单倍不足通过上调Arkadia水平促进肾脏纤维化[D];山东大学;2013年
7 梅淑钦;HIF-1α在早期糖尿病肾脏纤维化易感性中的作用机制研究[D];第二军医大学;2017年
8 赵凯;GSK3β促肾小管间质纤维化的分子机制及抗肾纤维化措施探讨[D];第三军医大学;2015年
9 刘丁;二次谐波与双光子激发荧光(SHG/TPEF)显微成像技术诊断肾脏纤维化的系统研究[D];南方医科大学;2015年
10 严雯;重组腺相关病毒载体介导的人核心蛋白聚糖基因逆转自发性高血压大鼠心肌纤维化的研究[D];华中科技大学;2009年
相关硕士学位论文 前10条
1 张明艳;油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究[D];兰州大学;2018年
2 冯晓剑;Wnt信号调控骨髓源巨噬细胞参与肾脏纤维化的作用及机制[D];山西医科大学;2018年
3 徐祖清;Klotho在IgA肾病患者血清及尿液中的表达水平及临床意义[D];延边大学;2017年
4 赵豪;次氯酸修饰白蛋白对肾脏纤维化大鼠线粒体功能的影响及抗氧化肽SS-31的保护作用[D];南方医科大学;2017年
5 王婕;12-脂氧化酶对鼠肾小球Ezh2表达的影响及机制研究[D];吉林大学;2015年
6 姚春萌;全反式维甲酸防治糖尿病肾脏纤维化的实验研究[D];福建医科大学;2008年
7 张尚;肾脏纤维化大鼠模型尿液及肾脏组织差异表达基因筛选及信息学分析[D];北京协和医学院;2017年
8 石田田;miRNA-9在低氧诱导的肾脏纤维化中的作用研究[D];第四军医大学;2017年
9 袁移安;基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9在肾脏纤维化中的作用[D];吉林大学;2004年
10 刘倩;RDN抑制IPiCMP心脏和肾脏纤维化的机制[D];南京医科大学;2016年
本文编号:
2890213