小鼠IFN-ε的可溶性表达及其对绝经后泌尿系感染的作用

发布时间：2020-12-08 11:05

　　目的构建小鼠IFN-ε蛋白的原核表达质粒,诱导表达和纯化后获得稳定的可溶性重组蛋白并验证其生物学活性。建立绝经后泌尿系感染的小鼠模型,观察IFN-ε对其治疗作用。方法1.将目的基因克隆到表达载体p ET28a-SUMO,和能同时表达三个分子伴侣gro ES、gro EL和tig的质粒p G-tf2一起转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱、Desalting柱、Q-HP柱及Superdex75分子筛层析经行纯化后,用Ulp1酶切,并对目标蛋白进行质谱分析。对目标蛋白抑制肿瘤细胞增长活性,刺激细胞产生抗病毒蛋白的活性进行了鉴定。2.选取IC R雌性健康小鼠分为两组,去势组和假手术组,并通过雌激素测定、阴道涂片的方法验证去势效果。用50μl UPEC对去势小鼠进行膀胱灌注,建立绝经后泌尿系感染的小鼠模型,24小时后处死小鼠,收集膀胱和尿液标本,将膀胱分为两部分,一部分和尿液标本一起进行细菌培养,另一部分常规病理切片,观察结果。按照上述方法建立绝经后泌尿系感染小鼠模型,分为去势感染组和去势感染治疗组,治疗组分别... 

【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

marker;1)小鼠IFN-ε的电泳产物

-ε 基因的 PCR 电泳图. M) marker; 1) 小鼠 IFN-ε 的电泳产物。 b) :M) m鼠 IFN-ε 的电泳图; 2) 重组质粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 的电泳图图 2-2-1 小鼠 IFN-ε 基因 PCR 产物电泳结果和重组质粒的 PCR 验证重组质粒和分子伴侣质粒的转化、表达和电泳质粒pET28a-SUMO-IFN-ε 分别和分子伴侣质粒pTf16、pG-tf2 及21(DE3)中，诱导表达小鼠 IFN-ε 蛋白。把培养后的细菌离心后ter 破碎菌体后离心，分别收集上清和沉淀并进行 SDS-PAGE 凝质粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侣 pG-tf2 一起表达时能生 蛋白量最多。

粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侣质粒 pG-KJE8 在上清中表达的蛋白；6) 重组质粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侣质粒 pG-KJE8 在沉淀中表达的蛋白；7) 重组质粒 pET28a-SUMO-IFN-ε和分子伴侣质粒 pTf16 在上清中表达的蛋白；8) 重组质粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侣质粒pTf16 在沉淀中表达的蛋白； M) 蛋白 marker2.2.3 重组小鼠 IFN-ε 蛋白的诱导表达和纯化将重组质粒pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侣质粒pG-tf2同时转化至 BL21(DE3)，过夜培养后挑取单克隆培养，然后再扩大培养至 4L，用浓度为 0.1 mmol/L IPTG 诱导目的蛋白的表达。收集的菌体重悬后在 4℃下高压破碎、离心、抽滤后得到清亮液体400 m 左右，依次经过 Ni 离子亲和层析、脱盐、阴离子交换层析和凝胶过滤层析后，在 57.05 ml 洗脱体积处出现洗脱峰峰值。在每一步纯化后各取 50 ul 样品进行SDS-PAGE 电泳，结果显示在分子量 Mr34000 处有单一条带，和 SUMO-IFN-ε 融合蛋白的大小相同。

【参考文献】：
期刊论文
[1]人IFN-ε的表达、纯化及生物学特性研究[J]. 李莉莉,张振龙.  中华微生物学和免疫学杂志. 2008 (08)



本文编号：2904985