人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达

发布时间：2022-02-14 11:06

　　目的：构建靶向人睾丸基因TDRG1的shRNA重组质粒表达载体,并研究其在人恶性畸胎瘤细胞（NTERA-2）的表达。筛选出高效且特异性抑制TDRG1基因表达的重组质粒表达载体,为下一步研究TDRG1基因对睾丸肿瘤生物学行为的作用奠定基础。方法：设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建了TDRG1-shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921和一个阴性对照,转化入JM109大肠杆菌,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定,分别使用LipofectamineTM2000介导转染重组质粒shRNA至人恶性畸胎瘤细胞中,再应用Real Time-PCR法检测转染后人恶性畸胎瘤细胞TDRG1mRNA的表达水平。结果：酶切结果表明,所有质粒均为阳性重组质粒,经基因测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486的人恶性畸胎瘤细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制（p<0.01）,并对TDRG1基因mRNA... 

【文章来源】：中南大学湖南省211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
1 前言
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 材料与试剂
        2.1.2 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 寡核苷酸的合成
        2.2.2 实验分组
        2.2.3 shRNA模板的退火
        2.2.4 pGPU6/GFP/Neo载体的线性化
        2.2.5 pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体的构建
        2.2.6 构建质粒酶切鉴定和DNA序列测序鉴定
        2.2.7 shRNA转染筛选有效序列
        2.2.8 应用Real time-PCR检测各组TDRG1mRNA表达水平实验
        2.2.9 统计学处理
3 结果
    3.1 重组表达载体的酶切鉴定
    3.2 荧光显微镜结果
    3.3 Real time-PCR检测结果
4 讨论
5 结论
参考文献
综述
    参考文献
附录
攻读学位期间主要的研究成果目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]组织芯片技术检测人睾丸基因TDRG1在睾丸肿瘤组织中的表达[J]. 陈厚仰,文甲明,肖小旺,李东杰,郭小亮,龙智,戴英波,汤育新.  中华男科学杂志. 2010(10)
[2]人睾丸特异表达基因TDRG1单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 文甲明,蒋先镇,汤育新,阳建福,陈厚仰,刘志中.  中南大学学报(医学版). 2010(03)
[3]睾丸肿瘤流行病学研究进展[J]. 张宏艳,刘端祺.  解放军医学杂志. 2007(03)
[4]一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆[J]. 蒋先镇,阳建福,汤育新,谭小军,李辉,张向阳,吴畏.  中国男科学杂志. 2006(07)
[5]PDE5抑制剂治疗ED研究进展[J]. 卢永宁,陈斌.  中华男科学杂志. 2005(07)



本文编号：3624436