hucMSC外泌体源miRNA NC 0 00019.10 1 3474在慢性肾纤维化模型中的作用及机制研究

发布时间：2024-03-13 03:53

　　目的肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病发展至终末期的一个共同的病理损伤过程。前期研究我们发现人脐带间充质干细胞外泌体(human umbilical cord mesenchy stem cell derived exosomes,hucMSC-Ex)可缓解大鼠肾间质纤维化,但具体作用机制尚不明确。外泌体来源的microRNAs(miRNAs)介导了细胞间的通讯行为,参与多种细胞生物学过程,并且在纤维化进程中发挥重要作用。因此,本研究拟从体内外探讨hucMSC-Ex携载miRNAs缓解肾间质纤维化的作用及具体机制。方法培养hucMSCs并收集培养上清,从中分离外泌体(hucMSC-Ex),对hucMSC-Ex进行形态大小及表面标记鉴定。建立大鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)肾间质纤维化模型,小动物活体成像检测DIR标记的hucMSC-Ex的体内分布。采用尾静脉注射hucMSC-Ex进行干预,以PBS或人肺成纤维细胞来源外泌体(human lung fibroblasts derived exosomes,HFL1-Ex)为对照。HE...

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略词中英文注释表
第一章 绪论
    1.1 肾纤维化
    1.2 肾间质纤维化相关分子机制
        1.2.1 TGF-β/Smad信号通路
        1.2.2 Wnt/β-catenin信号通路
        1.2.3 Notch信号通路
    1.3 人脐带间充质干细胞在肾脏损伤中的应用
        1.3.1 hucMSCs在组织再生中的应用
        1.3.2 hucMSCs在肾脏损伤修复中的作用
    1.4 人脐带间充质干细胞外泌体在组织再生中的应用
        1.4.1 hucMSC-Ex在多种疾病中的应用
        1.4.2 hucMSC-Ex在肾疾病中的应用
    1.5 Micro RNAs(miRNAs)在肾脏纤维化治疗中的作用
        1.5.1 促纤维化miRNA--miR-21
        1.5.2 抑纤维化miRNA--miR-29
        1.5.3 Exosomal miRNAs
第二章 研究目的、方案、意义
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法
    2.3 实验设计方案以及路线
        2.3.1 构建体内外模型,明确hucMSC-Ex的修复作用
        2.3.2 筛选hucMSC-Ex中的miRNAs,明确miRNA靶基因
        2.3.3 hucMSC-Ex缓解肾间质纤维化的作用机制
    2.4 研究意义
第三章 hucMSC-Ex缓解肾间质纤维化的实验研究
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 细胞株
        3.1.3 主要材料、试剂
        3.1.4 主要仪器、耗材
    3.2 实验方法
        3.2.1 hucMSC-Ex收集、提取及鉴定
        3.2.2 UUO及hucMSC-Ex治疗模型构建
        3.2.3 hucMSC-Ex标记进行动物活体成像
        3.2.4 天狼星红染色
        3.2.5 免疫组织化学法
        3.2.6 hucMSC-Ex处理活化的HK-2 细胞
        3.2.7 细胞/组织蛋白和总RNAs提取
        3.2.8 逆转录
        3.2.9 实时荧光定量PCR
        3.2.10 Western blot
        3.2.11 免疫荧光染色
        3.2.12 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 hucMSCs的培养及hucMSC-Ex的鉴定分析
        3.3.2 hucMSC-Ex改善大鼠肾脏结构,减少胶原沉积
        3.3.3 hucMSC-Ex缓解肾间质纤维化,抑制促纤维化因子表达
        3.3.4 hucMSC-Ex抑制TGF-β1 诱导的HK-2 细胞纤维样改变
    3.4 讨论
第四章 hucMSC-Ex转运miR-13474 靶向ADAM17
    4.1 实验材料与仪器
        4.1.1 实验动物
        4.1.2 细胞株
        4.1.3 主要材料、试剂
    4.2 主要仪器、耗材
    4.3 实验方法
        4.3.1 外泌体总RNA提取
        4.3.2 miRNAs提取
        4.3.3 miRNAs逆转录
        4.3.4 荧光定量PCR
        4.3.5 外泌体miRNAs测序
        4.3.6 琼脂糖凝胶电泳
        4.3.7 双荧光素酶报告基因检测
        4.3.8 细胞si RNA转染
        4.3.9 Western blot
        4.3.10 组织/细胞m RNAs提取、逆转录和荧光定量PCR
        4.3.11 组织/细胞蛋白提取及Western blot
        4.3.12 免疫组织化学和免疫荧光染色
    4.4 实验结果
        4.4.1 hucMSC-Ex高表达miR-13474
        4.4.2 hucMSC-Ex处理组高表达miR-13474
        4.4.3 Mi R-13474 靶向ADAM17
        4.4.4 hucMSC-Ex下调ADAM17表达
        4.4.5 ADAM17与miR-13474 的相互作用
    4.5 讨论
第五章 hucMSC-Ex-miR-13474 靶向ADAM17缓解肾间质纤维化的机制研究
    5.1 实验材料与仪器
        5.1.1 细胞株
        5.1.2 主要材料、试剂
        5.1.3 主要仪器、耗材
    5.2 实验方法
        5.2.1 细胞转染实验
        5.2.2 细胞m RNAs提取、逆转录和荧光定量PCR
        5.2.3 细胞miRNAs提取、逆转录和荧光定量PCR
        5.2.4 Western blot
        5.2.5 免疫荧光染色
        5.2.6 超声法
        5.2.7 平板克隆实验
        5.2.8 细胞凋亡检测实验
    5.3 实验结果
        5.3.1 过表达miR-13474 下调ADAM17表达,抑制TGF-β 和 α-SMA表达
        5.3.2 敲减miR-13474 促进ADAM17及TGF-β 和 α-SMA表达
        5.3.3 hucMSC-Ex-miR-13474 抑制ADAM17表达,抑制纤维化
        5.3.4 MiR-13474 促进细胞增殖,不影响细胞凋亡
    5.4 讨论
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加会议



本文编号：3927145