miR-146b/Merlin/YAP信号通路在hucMSC源Exosomes延缓糖尿病肾病中的作用机制研究

发布时间：2024-05-12 16:18

　　目的:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是一种严重的糖尿病微血管并发症,也是引起终末期肾病的首要原因。课题组前期研究发现miR-146b可能是急性肾损伤早期诊断及预后标志物,在此我们进一步探究人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,hucMSC-Ex)延缓DKD中miR-146b的作用机制,为hucMSC-Ex的临床应用提供新的实验依据。方法:以高脂饮食及链脲佐菌素(STZ)诱导构建DKD大鼠模型,正常SD大鼠(Normal组)为对照,取造模后8、16、24周肾组织,通过HE染色及Masson染色验证DKD模型构建成功;体外高糖环境下培养三种肾细胞,即大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)、大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)和大鼠足细胞(podocyte);提取大鼠肾组织及体外培养的肾细胞RNA检测miR-146b表达量。通过大量文献阅读及TargetScan软件预测miR-146b靶基因为NF2(2型神经纤维瘤),编码Merlin蛋白,双荧光...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略词中英文注释表
第一章 绪论
    1.1 间充质干细胞来源的外泌体
        1.1.1 外泌体的生物学特性
        1.1.2 间充质干细胞概述及应用
        1.1.3 人脐带间质干细胞来源的外泌体在疾病中的应用
    1.2 糖尿病肾病
        1.2.1 糖尿病肾病概述
        1.2.2 糖尿病肾病的发病机制
        1.2.3 糖尿病肾病与干细胞治疗
    1.3 microRNAs与糖尿病肾病
        1.3.1 microRNAs概述
        1.3.2 microRNA与糖尿病肾病
        1.3.3 miR-146b的研究现状
第二章 研究目的、方法、实验方案及意义
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法
    2.3 实验设计方案
        2.3.1 技术路线1
        2.3.2 技术路线2
        2.3.3 技术路线3
        2.3.4 技术路线4
    2.4 研究意义
第三章 miR-146b在糖尿病肾病发生发展中的作用研究
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 主要材料及试剂
        3.1.2 主要仪器及耗材
    3.2 方法
        3.2.1 糖尿病肾病大鼠模型构建
        3.2.2 细胞培养与体外模型构建
        3.2.3 HE染色
        3.2.4 Masson染色
        3.2.5 总RNA提取
        3.2.6 microRNA逆转录
        3.2.7 qRT-PCR
        3.2.8 数据处理与统计
    3.3 结果
        3.3.1 糖尿病肾病大鼠显示肾小球间质纤维化
        3.3.2 糖尿病肾病大鼠肾组织miR-146b表达升高
        3.3.3 高糖环境下miR-146b在 HBZY-1 表达升高
    3.4 讨论
第四章 miR-146b参与糖尿病肾病的作用机制研究
    4.1 实验材料与仪器
        4.1.1 主要材料、试剂
        4.1.2 主要仪器
    4.2 方法
        4.2.1 细胞培养及转染
        4.2.2双荧光素酶报告基因实验
        4.2.3 细胞蛋白提取
        4.2.4 Western Blot
        4.2.5 细胞RNA提取
        4.2.6 逆转录
        4.2.7 qRT-PCR
        4.2.8 免疫荧光
        4.2.9 数据处理与统计
    4.3 结果
        4.3.1 Merlin为 miR-146b的靶基因
        4.3.2 HBZY-1 转染miR-146b后验证下游通路
        4.3.3 HBZY-1 转染mi R-146b后Merlin/YAP细胞内定位
    4.4 讨论
第五章 hucMSC-Ex对糖尿病肾病的损伤修复作用研究
    5.1 实验材料与仪器
        5.1.1 主要材料、试剂
        5.1.2 主要仪器
    5.2 方法
        5.2.1 huc MSC-Ex提取及鉴定
        5.2.2 huc MSC-Ex修复体内模型构建
        5.2.3 细胞培养及处理
        5.2.4 免疫组织化学染色
        5.2.5 组织蛋白提取
        5.2.6 Western Blot
        5.2.7 q RT-PCR
        5.2.8 免疫荧光
        5.2.9 数据处理与统计
    5.3 结果
        5.3.1 huc MSC-Ex的鉴定
        5.3.2 huc MSC-Ex下调mi R-146b,促进Merlin表达减轻DKD肾损伤
        5.3.3 huc MSC-Ex体外抑制mi R-146b,上调Merlin改善肾细胞损伤
        5.3.4 免疫荧光检测Merlin/YAP细胞内定位
    5.4 讨论
第六章 hucMSC-Ex调控mi R-146b修复延缓糖尿病肾病的作用机制
    6.1 实验材料与仪器
        6.1.1 主要材料、试剂
        6.1.2 主要仪器、耗材
    6.2 方法
        6.2.1 huc MSC-Ex总RNA提取
        6.2.2 circ RNA逆转录与q RT-PCR
        6.2.3 细胞模型及si RNA转染
        6.2.4 细胞总RNA提取及q RT-PCR
        6.2.5 双荧光素酶报告基因实验
        6.2.6 Western Blot
        6.2.7 免疫荧光
        6.2.8 数据处理与统计
    6.3 结果
        6.3.1 huc MSC-Ex中筛选hsa_circ₀002940 为mi R-146b上游分子
        6.3.2 hsa_circ₀002940 靶向作用于mi R-146b
        6.3.3 hsa_circ₀002940 在细胞模型中huc MSC-Ex组表达升高
        6.3.4 hsa_circ₀002940 敲减后抑制huc MSC-Ex的功能
        6.3.5 hsa_circ₀002940 敲减后Merlin/YAP细胞内定位
    6.4 讨论
第七章 结论与展望
    1. 结论
    2. 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文与参加的会议



本文编号：3971577