活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化

发布时间：2017-05-27 14:07

  本文关键词：活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：终末期肾脏疾病最为理想及有效的治疗方法是肾移植。近年来，肾移植短期存活率有了明显提高，而肾移植远期存活率仍然不容乐观，移植肾慢性肾功能的丧失最终表现为肾纤维化。肾纤维化的主要病理学特征是肾小管萎缩同时伴有间质纤维组织增生。间质纤维组织大量累积是由肌成纤维细胞活化增生引起的，肌成纤维细胞的来源有多个学说，目前研究认为肌成纤维细胞的一个重要来源是肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化，即Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT）。 有实验表明，T淋巴细胞可以直接破坏肾小管基膜，表现为“小管炎”，并且肾移植排斥时有大量淋巴细胞浸润，因此以前人们都认为主要是T淋巴细胞介导肾移植排斥反应的发生。然而，有研究表明，肾移植排异中，间质也有巨噬细胞浸润，尤其是Banff Ⅰb及以上级别的排异中间质巨噬细胞浸润更多。基于以上研究，我们把目光集中在巨噬细胞上，研究巨噬细胞是否在肾小管上皮细胞的EMT过程中发挥重要作用。 目的：本实验采用脂多糖（LPS）体外激活鼠巨噬细胞株J774，然后用其培养上清诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E，观察其能否促使NRK52E细胞发生EMT，并通过分析活化巨噬细胞培养基中的细胞因子成分，进一步探讨巨噬细胞在促进EMT发生过程中的相关作用机制。 方法：鼠巨噬细胞(J774)分别在含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml脂多糖（LPS）的DMEM培养基中体外刺激24小时和48小时，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的情况，并观察用含2.5μg/ml LPS的DMEM培养基刺激24小时后J774的形态改变。将2.5μg/ml的LPS刺激24小时后的巨噬细胞消化离心，并用无血清DMEM培养基洗涤细胞沉淀三次，收集第三次洗涤培养基做对照培养基。然后用无血清DMEM培养基重悬巨噬细胞，继续培养48小时，离心取上清做诱导培养基。将NRK52E分为对照组和诱导组，对照组NRK52E的培养条件为对照培养基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最终浓度是5%，诱导组的培养条件为诱导培养基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最终浓度是5%。在倒置显微镜下观察培养48小时的对照组和诱导组NRK52E细胞，用Real-Time PCR、Western Blot和免疫细胞化学染色方法检测NRK52E细胞的上皮标记物，如E-钙粘蛋白（E-Ca），细胞角蛋白-19（CK19）和间充质标记物，如α-平滑肌动蛋白（α-SMA），Vimentin。并采用ESI质谱实验检测经LPS（2.5μg/ml）激活24小时的巨噬细胞J774上清中分泌的细胞因子。 结果： ELISA检测结果表明，未刺激组巨噬细胞J774用含LPS浓度为0的DMEM培养24小时或48小时后，J774培养上清中均未检测到TNF-α和IL-6的存在。刺激组巨噬细胞J774用含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml LPS的DMEM培养基培养24小时或48小时后，J774培养上清中都检测到有明确的TNF-α和IL-6分泌，表明不同浓度的LPS刺激J774作用24小时或48小时，都激活了J774巨噬细胞。但是用低浓度（1μg/ml）LPS刺激48小时与刺激24小时相比， J774上清中TNF-α和IL-6的含量都有下降，因此我们在后续激活巨噬细胞的实验中，选择LPS的刺激时间是24小时。当LPS浓度为2.5μg/ml，刺激巨噬细胞J774作用24小时后，J774培养上清中含有较高浓度的TNF-α和IL-6，因此综合考虑，，我们选择LPS激活巨噬细胞的浓度为2.5μg/ml，刺激时间为24小时。后续实验中，用LPS（2.5μg/ml）刺激J774作用24小时，倒置显微镜下发现J774由圆形伸出伪足，煎蛋样贴壁生长。以上结果表明，LPS在体外激活了J774细胞。 分别在对照培养条件下和诱导培养条件下培养NRK52E48小时后，与对照组相比，诱导组NRK52E形态发生变化，由连接紧密的铺路石样上皮细胞转化为细胞间隙增大的长梭形间质样细胞。Real-Time PCR结果表明，与对照组细胞相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物CK19的mRNA表达量降低，是对照组NRK52E的29%，而间充质标记物α-SMA的mRNA表达量上调，是对照组NRK52E的5.6倍。 Western Blot结果表明，与对照组相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物E-Ca蛋白的表达量明显减少，而间充质细胞标记物Vimentin和α-SMA的表达量都明显增加。免疫细胞化学染色结果也显示，与对照组相比，诱导组NRK52E细胞呈线状表达的上皮细胞标记物E-Ca蛋白的表达量明显降低。以上结果表明，与对照组相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物在mRNA和蛋白水平的表达量都有显著降低，同时其间叶细胞标记物在mRNA和蛋白水平的表达均增加，表明活化的巨噬细胞培养基体外诱导NRK52E48小时后，使其发生了EMT。 与此同时，ESI质谱检测结果表明，LPS刺激的巨噬细胞J774培养上清中，含有大量蛋白质，大部分是与代谢有关的酶，除此之外，还检测到几种较明确的细胞因子，主要包括：补体C3，热休克蛋白90（Hsp90），基质金属蛋白酶-9（MMP-9），骨桥蛋白（Osteopontin），转化生长因子-β（TGF-β），白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。 结论：LPS激活的巨噬细胞培养基能成功诱导NRK52E发生EMT，质谱分析显示LPS激活的大鼠巨噬细胞主要释放的细胞因子有：补体C3，Hsp90，MMP-9，Osteopontin，TGF-β，IL-6，和TNF-α。巨噬细胞通过释放上述因子诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生EMT。
【关键词】：巨噬细胞 肾小管上皮细胞 上皮-间充质细胞转分化 肾移植排异 肾纤维化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 中英文对照表13-14
• 第1章 绪论14-19
• 1.1 文献回顾14-17
• 1.1.1 肾小管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化(EMT)14-16
• 1.1.2 巨噬细胞在肾移植排斥中的作用16-17
• 1.2 引言17-19
• 第2章 材料和方法19-30
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 细胞株19
• 2.1.2 主要试剂19-20
• 2.1.3 其他试剂20
• 2.2 主要仪器20-21
• 2.3 实验方法21-29
• 2.3.1 肾小管上皮细胞（NRK52E）和巨噬细胞（J774）的传代、冻存与复苏21-22
• 2.3.2 体外激活 J774（巨噬细胞株）并检测激活后培养上清中的细胞因子22-23
• 2.3.3 诱导培养基的制备和体外培养 NRK52E 细胞的实验分组23-24
• 2.3.4 倒置显微镜观察诱导培养的 NRK52E 细胞形态改变24
• 2.3.5 Real-Time PCR 检测诱导培养的 NRK52E 细胞转分化状态24-26
• 2.3.6 Western Blot 检测诱导培养的 NRK52E 细胞转分化状态26-28
• 2.3.7 免疫细胞化学染色检测诱导培养的 NRK52E 细胞转分化状态28-29
• 2.3.8 ESI 质谱检测 LPS 激活的巨噬细胞 J774 培养上清29
• 2.4 统计学分析29-30
• 第3章 实验结果30-39
• 3.1 LPS 激活的 J774 培养上清中细胞因子的检测结果30-31
• 3.2 LPS 刺激后 J774 细胞形态改变31-32
• 3.3 巨噬细胞诱导培养基诱导 NRK52E 细胞转分化32-36
• 3.3.1 诱导后 NRK52E 细胞形态观察32-33
• 3.3.2 Real-Time PCR 检测 NRK52E 细胞转分化结果33-34
• 3.3.3 Western Blot 检测 NRK52E 细胞的转分化结果34-36
• 3.3.4 免疫细胞化学染色检测 NRK52E 细胞转分化结果36
• 3.4 ESI 质谱检测 J774 巨噬细胞培养上清中蛋白含量的结果36-39
• 第4章 讨论39-43
• 第5章 结论43-44
• 参考文献44-51
• 作者简介51-52
• 致谢52

【参考文献】

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1 齐隽,闵志廉,朱有华,王亚伟,任吉忠,郑军华,徐丹枫,周梅生,刘玉杉,陆健,王立明,姚亚成;影响肾移植后人、肾长期存活的因素分析[J];中华器官移植杂志;2004年03期

2 齐隽,闵志廉,朱有华,刘玉杉,陆健,王立明,王亚伟,任吉忠,郑军华,徐丹枫,周梅生,姚亚成,高轶;肾移植术后存活影响因素分析(英文)[J];中华外科杂志;2002年04期

  本文关键词：活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：400164