硫化氢对小鼠阻塞性肾损伤的保护作用

发布时间：2017-06-10 07:37

  本文关键词：硫化氢对小鼠阻塞性肾损伤的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景硫化氢(hydrogen sulfide)是在哺乳动物体内发现的继一氧化碳和一氧化氮之后的又一种新型气体信号分子,硫化氢可以在哺乳动物的很多组织和器官中被检测到表达,参与了生物体内各种的生理和病理活动并发挥着重要作用。最近的很多研究表明,硫化氢与多种阻塞性疾病有关,并且也有实验验证了硫化氢对肾脏纤维化具有保护作用。然而,硫化氢在肾脏纤维化中发挥的作用的具体的作用机制还不是很清楚和明确。慢性肾病是一种影响广泛的疾病,其主要的特点是肾小球滤过率逐步降低,最终会导致肾功能的衰竭。肾小管间质纤维化是影响慢性肾病的最为主要决定性的因素,发生的主要原因是细胞外基质的积聚以及肾间质肌成纤维细胞的增殖等缘故。单侧输尿管结扎模型(UUO)是梗阻性肾病肾小管间质纤维化的一个典型的模型,这个模型再现了阻塞性肾病最具代表性的特征,包括细胞渗透,肾小管细胞增殖和凋亡,以及上皮间质转化(EMT),成纤维化积累,细胞外基质(ECM)的沉积,以及肾小管萎缩等,并且这个疾病模型已应用于多个研究以评估在这些过程中所涉及的机制。由于UUO模型可以引起肾脏输尿管的完全梗阻,但是肾脏输尿管完全阻塞是很少发现在人类身上的,所以这是UUO模型的一个不足之处,但它的优点是可以快速地形成阻塞性肾病。自噬是一个细胞吞噬自身胞质内的蛋白质等分子或者细胞器并使其包裹进入囊泡,然后囊泡再与溶酶体进行融合,再利用溶酶体内的酶类复合物来降解其内部所包裹的内容物的过程,自噬可以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。有研究表明自噬在肾脏纤维化过程中起着重要的作用。目的探讨硫化氢在小鼠单侧输尿管结扎手术所引起的肾纤维化过程中的具体的保护作用,以及硫化氢在肾纤维化过程中可能的机制。方法将8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=5),实验组(n=5)和H2S处理的实验组(n=5)。在无菌条件下将实验组和硫化氢组小鼠左侧输尿管进行结扎处理,假手术组打开左侧肾脏外皮肤和肌肉,寻找到肾脏后即进行缝合。H2S组小鼠腹腔注射H2S供体硫氢化钠(Na HS),剂量为50μmol/次/天,对照组小鼠和假手术组小鼠注射等体积的生理盐水,每天一次。给药7天,建模后第7天经腹腔注射过量2%戊巴比妥钠麻醉剂处死小鼠。取出肾脏,从中间切开,一半用于切片做组织观察,一半用于提取蛋白和RNA。通过组织HE染色,观察实验组和硫化氢组和假手术组三组小鼠肾脏的组织结构有无差别,使用Masson染色方法,检测其胶原蛋白。核酸凝胶电泳检测CBS,CSE,3-MST等产生硫化氢气体的酶的RNA的表达情况;蛋白电泳检测LC3和Beclin-1的表达情况,评估其自噬水平;蛋白电泳检测肾脏fibronectin的表达情况,评估其纤维化程度。结果1.产硫化氢的酶CBS,CSE和3-MST的RNA表达量在手术后降低。2.UUO小鼠肾脏的胶原纤维染色比硫化氢处理组要多,且UUO小鼠肾脏纤维比假手术组要多。3.与假手术组小鼠相比,实验组小鼠肾脏中FN的蛋白表达增高很多;而硫化氢组小鼠的FN表达量比实验组小鼠的FN表达量要少。4.与假手术组小鼠相比,实验组小鼠肾脏中LC3-II蛋白和Beclin-1蛋白的表达增高很多;而硫化氢组小鼠的LC3-II和Beclin-1蛋白表达量比实验组小鼠的LC3-II表达量要多。结论在小鼠肾脏输尿管结扎手术之后,小鼠的自噬水平相比之前增加很多,而硫化氢提高了肾脏细胞的自噬水平;输尿管结扎手术后小鼠的肾脏发生纤维化,硫化氢减轻了纤维化水平;硫化氢可能通过自噬减轻输尿管结扎所引起的纤维化。
【关键词】：小鼠 UUO 硫化氢 纤维化 自噬
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACTS6-11
• 英文缩略词表11-12
• 一、引言12-14
• 二、动物模型制作与取材14-16
• 2.1 动物模型制作14
• 2.2 标本采集与保存14-16
• 三、主要实验仪器、试剂16-24
• 3.1 试剂和耗材16-17
• 3.2 主要实验仪器17-20
• 3.3 部分试剂配制20-24
• 四、实验方法与步骤24-32
• 4.1 组织采集24
• 4.2 RNA的提取24
• 4.3 RNA的纯化24-25
• 4.4 RNA的反转录25
• 4.5 半定量PCR25-26
• 4.6 琼脂糖凝胶电泳26-27
• 4.7 组织切片27-28
• 4.8 Masson染色28-29
• 4.9 检测血清中的胱抑素C29
• 4.10 Western blot检测肾组织LC3及beclin1等蛋白的表达29-31
• 4.10.1 蛋白质的提取和浓度测量29
• 4.10.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳29-31
• 4.11统计学分析31-32
• 五、实验结果32-38
• 5.1 CBS，CSE，3 MST在各组肾脏中的表达差别32-33
• 5.2 硫化氢减轻UUO模型肾脏结构损伤33
• 5.3 硫化氢对UUO模型小鼠肾功能损伤有保护作用33-34
• 5.4 硫化氢减轻UUO小鼠肾脏纤维化34-35
• 5.5 UUO模型小鼠肾脏中FN的表达35
• 5.6 硫化氢促进UUO模型小鼠肾脏自噬水平增高35-38
• 六、讨论38-44
• 结论44-46
• 参考文献46-50
• 综述50-63
• 参考文献58-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文64-65

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本文编号：437697