移植肾急性排斥反应血浆MicroRNA表达谱筛查

发布时间：2017-07-16 14:12

  本文关键词：移植肾急性排斥反应血浆MicroRNA表达谱筛查

  更多相关文章： microRNA 肾移植 急性排斥反应 微阵列分析 聚合酶链反应

【摘要】：[背景]肾移植目前已成为治疗终末期肾病(End-Stage Renal Disease, ESRD)的有效手段,随着新型免疫抑制剂的不断研发,加之组织配型技术的日渐成熟,移植肾存活率不断提高,远期疗效逐渐改善,但术后排斥反应的发生仍然是导致慢性移植肾功能不全(Chronic Renal Allograft Dysfunction, CRAD)的重要因素,其中急性排斥反应(Acute Rejection, AR)被认为是引起CRAD的主要免疫性危险因素,这使得AR的早期诊断及治疗变得尤为重要。目前临床诊断AR的金标准为移植肾穿刺活检(needle-core biopsy, NCB),虽然活检并发症的发生率较低,但其毕竟为有创检查,且可能需多次穿刺才能符合AR的病理诊断标准,同时由于抽样误差、不同病理医师间诊断水平参差不齐等因素的影响,均可能增加误诊的风险。因此,临床上迫切需要从肾移植受者的血液或尿液中,无创检测出一种具有高敏感性、高特异性及可重复性强等特点的生物学标记物,要求其能够反应肾移植受者机体的免疫状态,并能辅助临床医生明确诊断AR。MicroRNA是一类在人体内广泛分布的内源性非编码小分子单链RNA,通常由18-22个核苷酸组成。研究表明miRNA广泛参与细胞生理活动的各个环节,并影响机体免疫系统的调节,其异常表达被证明与多种疾病进程密切相关。同时,由于miRNA存在于体液中的外泌体(exsomes)内,可帮助其抵御RNA酶的降解,致使血浆中的miRNA得以稳定存在。因此研究认为,外周血miRNA有可能成为理想的新型疾病分子标记物。目前已有多项研究表明miRNA与肾移植术后发生AR相关,但由于样本来源、检测方法、对照组选择等因素的不同,各研究实验结果并不完全相符,甚至存在相互矛盾的现象。本实验利用高通量miRNA芯片检测技术,筛选出肾移植AR患者血浆中miRNA的特异性表达谱,并采用独立样本通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对芯片结果进行验证,以期寻找可稳定于血浆中检测到的、与肾移植AR发生密切相关的miRNA,作为诊断AR的新型生物学标记物用于临床。[目的]拟通过microRNA芯片高通量分析可能与肾移植急性排斥反应发生相关的microRNA标志物,并采用独立样本通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术验证芯片检测结果,为后续研究肾移植急性排斥反应发生机制提供理论及数据依据,为临床无创诊断肾移植急性排斥反应寻找可能的新型生物学标记物。[方法]1.肾移植急性排斥反应发生相关的microRNA标记物筛选1.1实验分组：获取3例肾移植术后发生AR患者的血浆,归为AR组；获取3例同期行肾移植术,但未发生AR患者的血浆,归为非AR组。1.2指标检测：microRNA芯片分别检测两组血浆样本microRNA表达情况。1.3数据分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据,使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析,获得两组样本各自microRNA表达谱以及两组间microRNA的差异表达情况。2.肾移植急性排斥反应发生相关的microRNA临床验证2.1实验分组：获取10例肾移植术后发生AR患者的血浆,归为AR组；获取10例同期行肾移植术,但未发生AR患者的血浆,归为非AR组；获取10例健康成人的血浆,归为正常对照组。2.2指标检测：结合芯片实验结果及相关文献报道,通过RT-qPCR方法分别检测各组血浆样本中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p的表达情况。2.3数据分析:采用SPSS 17.0软件进行数据处理,多组计量资料的比较使用单因素方差分析,两两比较使用q检验；两组计量资料的比较使用独立样本的t检验,计量资料使用x±s表示。p0.05认为差异具有统计学意义。[结果]1.芯片实验结果显示：1.1肾移植AR组与非AR组间,共有20个表达差异显著(P0.05)的miRNA;1.2在20个表达差异显著的miRNA中13个表达显著上调,分别为：hsa-miR-142-5p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-130a-3p、 hsa-miR-24-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-4286、hsa-miR-3135b、 hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-574-5p;1.3在20个表达差异显著的miRNA中7个miRNA表达显著下调,分别为：hsa-miR-6854-5p、hsa-miR-4694-5p、hsa-miR-559、hsa-miR-8064、hsa-miR-645、 hsa-miR-7108-5p、hsa-miR-6727-5p。2.实时荧光定量PCR实验结果：与非AR组及正常对照组相比,AR组血浆样本中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p的表达显著上调,差异具有统计学意义(P0.001),并与芯片检测结果相一致。[结论]1.利用微阵列芯片技术进行筛选,结合定量PCR技术进行验证的实验方法,是筛选肾移植AR发生相关miRNA的有效研究手段。2.相比非AR组及正常对照组,AR组中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p表达显著上调,以上3个miRNA可能与肾移植急性排斥反应的发生有关。3.AR组患者与非AR组患者相比,血浆中共有20个miRNA表达具有差异,其中13个表达上调,7个表达下调,这些表达差异可作为进一步筛选AR发生相关miRNA的数据依据。
【关键词】：microRNA 肾移植 急性排斥反应 微阵列分析 聚合酶链反应
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R699.2
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-26
• 1 肾移植急性排斥反应发生相关的microRNA标记物筛选15-20
• 1.1 实验材料15-17
• 1.2 实验方法17-20
• 2 肾移植急性排斥反应发生相关的microRNA临床验证20-26
• 2.1 实验材料20-21
• 2.2 实验方法21-26
• 结果26-33
• 1 芯片实验结果26-28
• 2 实时荧光定量PCR检测miRNA结果28-33
• 讨论33-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 综述42-49
• 参考文献47-49
• 攻读学位期问获得的学术成果49-50
• 致谢50

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