双酚A对雄性小鼠生殖和睾丸GPER表达的影响及与肾虚不育的相关性研究

发布时间：2017-07-17 21:20

  本文关键词：双酚A对雄性小鼠生殖和睾丸GPER表达的影响及与肾虚不育的相关性研究

  更多相关文章： BPA 肾虚 行为学 精液质量 GPER 相关性

【摘要】：随着工业化进程的加剧,大量环境雌激素(Environmental estrogens,EEs)的释放造成雄性生精功能障碍,因尚无行之有效防治方法,已引起国内外生态学家及毒理学家的极大关注[1]。双酚A(Bisphenol-A,BPA)作为一类典型的EEs,是对男性生殖健康危害极大的一类环境污染物。由于BPA导致的雄性生殖障碍与肾虚不育不仅均出现精子生成的异常,还出现了相关的行为学改变,同时,补肾药物能够拮抗BPA引起的雄性生殖障碍的作用。我们的研究也表明[2],肾阳虚不育大鼠不仅出现了精液质量降低,还出现体质量减轻、反应迟钝、弓背蜷缩、畏寒、体毛枯疏无光等改变,经灌服金匮肾气丸后,上述表现均有所改善。依据中医“肾主生殖”与“方证相应”的理论,我们推测BPA引起的雄性生殖障碍可能属于肾虚不育的范畴。由于观察动物高架十字迷宫、旷场实验、游泳力竭时间等行为学改变,可反映其活动量、惊恐状态及耐力表现;且雄性动物精液质量及育仔数是判断动物生育能力的最直观指标;另外,睾酮(Testosterone,T)、雌二醇(Estradiol,E2)和T/E2水平异常与雄性不育关系密切[3];同时,G蛋白偶联雌激素受体(G protein coupled estrogen receptor,GPER)既能够通过雌激素介导快速非基因组效应,也能够间接调控基因的转录活性,调控雄性生殖细胞增殖与分化[4]。因此,我们将从行为学、雌雄激素水平及睾丸GPER蛋白表达等方面,对BPA致雄性生殖障碍作用机制与肾虚不育的相关性进行比较,以探讨BPA导致的生殖障碍是否属于肾虚不育的范畴,不仅可为防治BPA导致的雄性生殖障碍,而且可为男性不育的治疗提供新的思路与策略。第一部分:BPA与肾虚致生殖障碍小鼠的行为学改变目的:观察实验小鼠行为学改变,探讨BPA致雄性生殖障碍与肾虚不育的相关性。方法:1)将小鼠置于代谢笼中,监测小鼠每日体重、睾丸重量、饮水量和尿量变化。2)采用高架十字迷宫装置,通过计算机数字化采样和分析技术检测各组小鼠开臂进入次数所占总进入长臂的百分比以及开臂滞留时间所占总测试时间的百分比,评价小鼠惊恐和焦虑程度,以判断其活动度与惊恐程度。3)采用旷场实验仪器,通过数据分析系统,自动分析小鼠活动度,检测小鼠中央区进入次数、中央区滞留时间百分比,评价小鼠活动和焦虑程度,以判断其活动度与惊恐程度。4)将小鼠置于长、宽为65cm×50cm长方形水池中,水深50cm,采用负重游泳方式,于小鼠尾根部下3 cm处固定相当于小鼠5%体质量的铅丝,使其自行游泳,以淹没入水中5 s并且连续3次者为游泳力竭表现,记录各组小鼠力竭时间,评价小鼠的耐力。结果:1)与正常组相比,BPA组小鼠体质量明显减轻(P0.05),睾丸重量亦明显减轻(P0.01)。与BPA组相比,肾阳虚组小鼠体质量无明显变化(P0.05),睾丸重量虽有增加,但差异无统计学意义(P0.05);肾阴虚组小鼠体质量明显减轻(P0.01),睾丸重量变化无统计学意义(P0.05)。2)与正常组相比,BPA组与肾阳虚组小鼠饮水量于造模第5天开始,呈下降趋势(P0.05),两组小鼠尿量从第6天开始均显著增加(P0.05),两组之间无显著性差异(P0.05)。与BPA组比较,肾阴虚组小鼠于造模第3天开始饮水量明显增多(P0.05),尿量则无显著性差异(P0.05)。3)与正常组相比,BPA组小鼠开臂进入次数和滞留时间百分比明显减少(P0.01);与BPA组相比,肾阳虚组小鼠开臂进入次数和滞留时间百分比无明显变化(P0.05),肾阴虚组小鼠开臂进入次数百分比明显增加(P0.01),而开臂滞留时间百分比无明显变化(P0.05)。4)与正常组相比,BPA组小鼠中央区进入次数减少(P0.05),中央区滞留时间百分比亦明显减少(P0.01)。与BPA组相比,肾阳虚组小鼠中央区进入次数显著减少(P0.05),中央区滞留时间百分比无明显变化(P0.05);肾阴虚组小鼠中央区进入次数明显减少(P0.01),中央区滞留时间百分比显著增加(P0.05)。5)与正常组相比,BPA组小鼠游泳力竭时间明显缩短(P0.01)。与BPA组相比,肾阳虚组小鼠游泳力竭时间变化无统计学意义(P0.05);而肾阴虚组小鼠游泳力竭时间显著增加(P0.05)。6)与正常组相比,BPA组和肾阳虚组小鼠均出现了更为明显的畏寒、蜷缩,毛发干枯、无光泽、并出现稀疏脱落的现象,从水中捞出到毛发完全变干的时间也明显延长,而肾阴虚组毛发干枯、无光泽、并出现稀疏脱落,但无明显畏寒、蜷缩的表现。结论:BPA组与肾阳虚组小鼠体质量、睾丸重量、饮水量及尿量等方面改变相似,而肾阴虚小鼠的体质量下降更为显著,饮水量也增加明显,但尿量较前两组减少。BPA组与肾阳虚组小鼠均出现惊恐状态、活动度减少及耐力下降,并伴毛发干枯、无光泽、并出现稀疏脱落等行为学表现;而肾阴虚组也出现了惊恐状态,活动次数增多,虽耐力也下降,但较BPA组与肾阳虚组增加,并出现毛发干枯、无光泽、稀疏脱落等,但无明显畏寒、蜷缩的表现。由此得出,BPA导致雄性小鼠生精障碍模型与肾阳虚不育模型更为相似。第二部分:BPA与肾虚致生殖障碍小鼠精液质量和雌雄激素水平的变化目的:检测小鼠精子数量、精子活动率和畸形精子百分率及血清T、E2及T/E2,探讨BPA与肾虚诱导生殖障碍小鼠在精液质量和雌雄激素水平的相关性。方法:1)采用罗氏化学发光法检测血清T、E2、并计算T/E2的比值。2)3)将输精管内精液挤出,并将附睾尾剪碎,加入3ml生理盐水,游离精子,制成精子悬液,在37℃水浴中孵育,使其充分液化。将精子悬液置于全自动精子分析仪(SQAV)进行分析,检测精子计数、精子百分率、精子畸形率。将各组雄性小鼠与发情期成年雌性小鼠同笼,雌雄比例为3:1,观察检测同雄鼠育仔数。结果:1)与正常组相比,BPA组小鼠血清T和T/E2比值明显降低(P0.01),E2变化无统计学意义(P0.05)。与BPA组比较,肾阳虚组小鼠血清T变化无统计学意义(P0.05),E2略有降低,但无统计学意义(P0.05),T/E2比值升高,(P0.05);肾阴虚组小鼠血清T明显升高(P0.01),E2及T/E2比值均升高(P0.05)。2)与正常组相比,BPA组小鼠精子计数、活动精子百分率明显降低,而精子畸形百分率增加(P0.01)。与BPA组比较,肾阳虚组小鼠精子数量与精子畸形率变化无统计学意义(P0.05),但活动精子百分率增加(P0.05);肾阴虚组小鼠精子数量增加明显(P0.01),活动精子百分率显著增加(P0.05),精子畸形率降低(P0.05)。3)与正常组相比,BPA组平均每只雄鼠与雌鼠育仔数为3.8只,且其中有4只雌鼠未怀孕(P0.05)。与BPA组相比,肾阳虚组平均每只雄鼠与雌鼠育仔数为4.33只,其中有4只雌鼠未怀孕,差异无统计学意义(P0.05);肾阴虚组平均每只雄鼠与雌鼠育仔数为6.46只,其中有4只雌鼠未怀孕(P0.05)。结论:BPA组与肾阳虚组小鼠血清T降低,而E2变化不显,T/E2比值显著下降;与BPA组相比,肾阴虚组小鼠T、E2及T/E2比值均增加;BPA组与肾阳虚组小鼠精子计数减少,精子畸形百分率增加,BPA组活动精子百分率明显低于肾阳虚组小鼠;而肾阴虚组小鼠精子数量、活动精子百分率及精子畸形率均增加。在育仔数方面,BPA组与肾阳虚组相近;肾阴虚组则较BPA组增加。由此得出,BPA组与肾阳虚组在血清T、E2和T/E2以及精子计数和精子畸形百分率具有相关性。第三部分:GPER在BPA与肾虚致生殖障碍小鼠睾丸的表达目的:观察睾丸GPER表达,探讨BPA与肾虚致生精障碍小鼠发病机制的相关性。方法:1)采用HE染色法,观察睾丸结构变化。2)采用免疫组化染色(SABC)法,观察睾丸GPER的定位及表达。3)采用免疫荧光染色法,观察睾丸GPER表达,并比较。结果:1)与正常组相比,BPA组、肾阴虚组和肾阳虚组小鼠睾丸曲细精管均呈不同程度的官腔壁受损、变薄,基膜连续性受到损坏,且生殖细胞呈杂乱无序排列,间质细胞分布不均匀,生精上皮细胞层减少,腔内精子数量减少。2)GPER在小鼠睾丸间质细胞有表达,其免疫反应阳性物质位于间质细胞的胞质及胞膜内,细胞核内为阴性,在曲细精管内的支持细胞及各级生精细胞均未见表达。3)正常组小鼠睾丸GPER呈阳性表达,荧光较弱,但可清楚可见(+);BPA组GPER呈过高表达,荧光明亮,清晰可见(+++),与正常对照组相比有显著差异(P0.05);肾阳虚组GPER同样呈过高表达,荧光明亮,清晰可见(+++),与BPA组相比无显著性差异(P0.05);肾阴虚组GPER表达下调,荧光较暗,但清晰可见(+),与BPA组相比明显减弱(P0.05)。阴性对照无荧光表达(-)。结论:BPA组、肾阳虚组及肾阴虚组小鼠均出现了睾丸组织结构均受损。GPER表达于睾丸间质细胞质及细胞膜上,肾阳虚组小鼠睾丸GPER表达明显上调、清晰可见与BPA组相近,与BPA组相比,肾阴虚组小鼠睾丸GPER虽呈阳性,但表达量明显下调。由此得出,BPA与肾阳虚导致的生精障碍小鼠睾丸间质细胞GPER表达上调,引起性激素水平紊乱,精子质量下降,导致雄性生殖障碍。
【关键词】：BPA 肾虚 行为学 精液质量 GPER 相关性
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-19
• 文献回顾19-30
• 第一部分 BPA与肾虚致生精障碍小鼠行为学改变30-39
• 引言30
• 1 材料30-31
• 2 方法31-33
• 3 结果33-36
• 4 结论36
• 5 讨论36-39
• 第二部分 BPA与肾虚致生精障碍小鼠的精液质量及雌雄激素水平39-45
• 引言39
• 1 材料39-40
• 2 方法40
• 3 结果40-42
• 4 结论42
• 5 讨论42-45
• 第三部分 GPER在BPA与肾虚致生精障碍小鼠睾丸的表达45-54
• 引言45
• 1 材料45-46
• 2 方法46-47
• 3 结果47-52
• 4 结论52
• 5 讨论52-54
• 小结54-55
• 参考文献55-61
• 附录61-64
• 个人简历和研究成果64-65
• 致谢65

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本文编号：554656