M3受体、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱组织中的表达及意义

发布时间：2017-07-31 03:01

  本文关键词：M3受体、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱组织中的表达及意义

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【摘要】：目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由多种病因所引起的以慢性血糖升高为主要表现的代谢性疾病,是由于胰岛素分泌不足和(或)其作用缺陷引起的。糖尿病随着病程的进展会出现心血管系统、神经系统及泌尿系统等多系统慢性进行性病变。糖尿病泌尿系统发症中最常见的是糖尿病膀胱功能障碍(DBD)。糖尿病膀胱功能障碍(DBD)目前是指一组临床症候群,主要包括储尿期及排尿期功能障碍,临床表现有膀胱过度活动(OAB)、膀胱感觉减退、排尿后膀胱残余尿量增加和逼尿肌收缩力下降。因其发病机制较为复杂,尚未被完全阐明,故该病诊治目前仍比较困难。毒蕈碱型受体M3受体与乙酰胆碱(ACh)结合后会直接引起平滑肌细胞兴奋收缩。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK),是调节平滑肌细胞收缩的关键蛋白。目前普遍认为,副交感神经释放的乙酰胆碱与膀胱平滑肌细胞上M3受体结合后使胞浆内游离钙浓度迅速升高。升高的钙离子与胞浆中无活性钙调蛋白(calmodulin,Ca M)结合后成为具有活性的Ca~(2+)-Ca M复合体并使细胞内MLCK激活,被激活的MLCK使肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化(即p-MLC),从而使肌球蛋白头部Mg~(2+)-ATP酶被激活,此酶水解ATP产生的能量使肌动蛋白和肌球蛋白相互作用,从而引发膀胱平滑肌收缩。这一机制在糖尿病小鼠模型中是否发生障碍,目前国内外还未见相关研究报道。我们使用C57BL/6小鼠建立1型糖尿病模型,应用免疫组化及Western blot的实验方法研究M3受体、MLCK及p-MLC在小鼠膀胱组织中的表达,从而探究DBD的发病机制。方法:1实验动物分组:36只C57BL/6小鼠适应性喂养1周后被随机分为6组,即正常对照组A1、B1、C1,1型糖尿病组A2、B2、C2,每组各6只。A1及A2组、B1及B2组、C1及C2组分别于糖尿病病程8周、20周及24周时处死小鼠进行实验。2 1型糖尿病小鼠模型制备:将小鼠禁食8小时后称取其体重,按0.2mg/g的剂量腹腔注射已配制好的STZ溶液,72小时后尾静脉取血使用血糖仪及血糖试纸监测小鼠的血糖变化,空腹血糖连续3次检测大于18mmol/l即认定为1型糖尿病模型制备成功。3于糖尿病病程8周、20周及24周时处死小鼠取出膀胱组织,进行膀胱组织的固定、包埋和切片。4苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)观察小鼠膀胱组织的形态结构变化。5免疫组化检测小鼠膀胱组织上M3受体、MLCK、p-MLC的表达及定量分析。6 Western blot检测小鼠膀胱组织上M3受体、MLCK、p-MLC的表达及定量分析。结果:1给予C57BL/6小鼠腹腔注射STZ后,72小时后尾静脉取血测空腹血糖,血糖均大于18mmol/L,所以认定1型糖尿病小鼠模型造模成功。在第8周(P0.05)、20周(P0.05)及24周(P0.05)时分别检测小鼠体重后发现,和正常对照组小鼠相比,1型糖尿病组小鼠体重均明显下降。经STZ腹腔注射处理的C57BL/6小鼠血糖与正常对照组小鼠相比,于第8周(P0.05)、20周(P0.05)及24周(P0.05)时显著升高。2病理形态学观察与正常对照组相比,1型糖尿病组小鼠膀胱尿路上皮完整,细胞排列整齐,无上皮糜烂及溃疡形成,膀胱平滑肌细胞无明显变性、肥大及萎缩。3免疫组化实验3.1 M3受体主要在小鼠膀胱平滑肌细胞胞浆、膀胱尿路上皮细胞胞浆内表达,部分膀胱平滑肌细胞膜上可见表达。免疫组化定量分析显示,糖尿病病程8周、20周及24周时,M3受体在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌中表达均高于正常对照组(P0.05),M3受体在1型糖尿病小鼠膀胱尿路上皮中表达在糖尿病病程8周时高于正常对照组(P0.05),在糖尿病病程20周和24周时与正常对照组差异均无统计学意义。3.2 MLCK主要在小鼠膀胱平滑肌细胞及膀胱尿路上皮细胞胞浆内表达,在膀胱尿路上皮细胞下层中毛细血管内皮也可见表达;免疫组化定量分析显示,糖尿病病程8周、20周及24周时,MLCK在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌中表达均高于正常对照组(P0.05),在1型糖尿病小鼠膀胱尿路上皮中表达与正常对照组差异均无统计学意义。3.3 p-MLC主要在小鼠膀胱平滑肌细胞及膀胱尿路上皮细胞胞浆内表达,在膀胱尿路上皮细胞下层中毛细血管内皮也可见表达;免疫组化定量分析显示,糖尿病病程8周、20周及24周时,p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌中表达均高于正常对照组(P0.05),在1型糖尿病小鼠膀胱尿路上皮中表达与正常对照组差异均无统计学意义。4 Western blot实验4.1 M3受体在1型糖尿病小鼠膀胱组织中的表达于糖尿病病程8周、20周及24周时均高于正常对照组(P0.05)。4.2 MLCK在1型糖尿病小鼠膀胱组织中的表达于糖尿病病程8周、20周及24周时均高于正常对照组(P0.05)。4.3 p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱组织中的表达于糖尿病病程8周、20周及24周时均高于正常对照组(P0.05)。结论:1糖尿病病程8周、20周及24周时,M3受体、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱组织中表达均高于正常对照组,且主要在膀胱平滑肌细胞中表达增高,表明在糖尿病发病过程中,M3受体介导的膀胱平滑肌细胞收缩机制被激活。2糖尿病病程8周时,M3受体、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌细胞中表达增高,理论上可引起膀胱平滑肌收缩增强,这可能是DBD早期膀胱过度活动(OAB)产生的原因之一。3糖尿病病程20周及24周时,M3受体、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌细胞中表达增高,这与DBD进展期膀胱收缩功能障碍的表现不平行,考虑此时三者表达增高为膀胱平滑肌细胞代偿性变化,但DBD的发病为多种因素所致,最终膀胱平滑肌收缩功能随着糖尿病的进展会出现失代偿变化,具体机制尚待进一步研究。
【关键词】：糖尿病 糖尿病膀胱功能障碍 M3受体 MLCK p-MLC 免疫组化
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R694
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文缩写12-13
• 前言13-16
• 材料与方法16-26
• 结果26-30
• 附图30-43
• 附表43-46
• 讨论46-49
• 结论49-50
• 参考文献50-53
• 综述 糖尿病膀胱功能障碍的研究进展53-66
• 参考文献60-66
• 致谢66-67
• 个人简历67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 高宏飞;王东文;;2型糖尿病膀胱重构的受体机制研究[J];中西医结合心脑血管病杂志;2013年06期

2 双卫兵;王东文;吴博威;;糖尿病大鼠逼尿肌细胞内游离钙离子浓度的变化[J];中华实验外科杂志;2006年04期

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本文编号：597143