联合嗅鞘细胞及GDNF的生物可降解膜系统的性质研究

发布时间：2017-08-19 12:28

  本文关键词：联合嗅鞘细胞及GDNF的生物可降解膜系统的性质研究

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【摘要】：神经修复在临床上一直是一个困扰着临床医生的难题,近年来随着科学的进步,在损伤神经修复方面获得了可喜的进步。而目前前列腺癌的发病率逐年上升,其治疗的金标准是采用根治手术切除前列腺,而手术过程中会因为钳夹、烧灼、牵拉等原因不可避免的造成海绵体神经的损伤。更为特殊的是,海绵体神经拥有着独特的网状神经结构,目前仍没有理想的方式来进行受损海绵体神经的修复。针对海绵体神经的特殊解剖学结构,我们拟采用膜状结构全面覆盖在受损的海绵体神经段上,以起到支撑、保护和引导海绵体神经再生的作用。静电纺丝技术是目前支架结构的新兴技术,应用该技术制造的纳米纤维支架具有较大的比表面积和较高的孔隙率,不但有利于生长因子、酶等生物大分子的吸附,还有利于细胞的附着和铺展,同时有利于细胞和微环境之间进行物质交换。聚乳酸—乙醇酸聚合物[Poly(DL-lactic-co-glycolicacid),PLGA]具有良好的生物相容性和可降解性,运用静电纺丝技术和PLGA材料可以制作出理想的细胞支架。嗅鞘细胞(Olfactory Ensheathing cells,OECs)是来源于嗅上皮基底膜的神经胶质细胞,其分布区域位于嗅神经和嗅球,可分泌多种神经营养因子和神经细胞粘附因子,起到帮助损伤神经元存活、促进轴突再生和髓鞘化的作用,在神经再生中扮演着重要的角色。GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)是最有效的体外支持运动神经元生长的神经营养因子,具有保护损伤神经、减少神经元死亡、促进神经纤维再生和帮助运动功能重建的功效。在第一部分,我们采用了改良的Nash法培养了高纯度的OECs,免疫荧光鉴定了其纯度。在第二部分,我们采用慢病毒转染嗅鞘细胞获得了高表达GDNF的嗅鞘细胞,并用GFP荧光表达、蛋白印迹和PCR法加以证实。第三部分,我们将高表达GDNF的OECs种于电纺PLGA膜上,从体内及体外实验共同验证了其生物相容性。最终我们得到了联合嗅鞘细胞及GDNF的电纺PLGA可降解膜系统,这是一个理想的生物工程学神经移植物。第一部分嗅球源OECs分离、培养及鉴定目的从大鼠嗅球取材原代嗅鞘细胞,光镜下观察细胞状态和增殖情况,运用免疫荧光技术鉴定嗅鞘细胞纯度。方法采用改良的Nash法从120g大鼠嗅球中取材嗅鞘细胞,运用包含b FGF、Forskolin和20%FBS的DEME/F12完全培养液培养嗅鞘细胞,在光镜下观察细胞状态和增殖情况,使用p75NGFR免疫荧光染色鉴定嗅鞘细胞纯度。结果采用改良的nash法,我们成功的获得了活性高、状态好、增殖能力强的嗅鞘细胞,体外最长培养时间可长达30天,但是细胞活性状态较好的天数为14天内。p75NGFR免疫荧光显示嗅鞘细胞纯度在95%以上。结论采用改良的nash法可以获得高纯度的原代嗅鞘细胞,但是嗅鞘细胞是成熟的体细胞,不具有无限增殖的特性,在体外虽然可以大量增殖,但是存活时间有限,需要在30天内进行相关实验,超过30天后细胞活性差且细胞大量死亡,最佳天数是在14天以内进行相关实验。第二部分慢病毒转染获得高表达GDNF的嗅鞘细胞及鉴定目的获得高表达GDNF的嗅鞘细胞,并鉴定其能否高表达GDNF。以联合GDNF和嗅鞘细胞共同用于神经修复。方法运用含有GDNF基因的慢病毒转染嗅鞘细胞,在荧光下观察细胞GFP荧光表达情况确定病毒转染率,应用PCR验证GDNF基因过表达情况,应用蛋白印迹验证GDNF蛋白生成情况。结果荧光下观察到细胞GFP表达在MOL为50:1的情况下为50%,表明病毒转染率为50%。同时PCR验证GDNF基因过表达情况为对照组正常细胞的130倍。蛋白印迹分析显示高表达GDNF的嗅鞘细胞能产生GDNF蛋白,而正常的嗅鞘细胞蛋白印迹结果为阴性。结论通过慢病毒转染嗅鞘细胞可以获得高表达GDNF的嗅鞘细胞,其细胞状态好,增殖活性强,能够用于细胞移植来修复神经。第三部分电纺PLGA膜与嗅鞘细胞生物相容性研究目的探索大鼠嗅鞘细胞和静电纺丝制作的PLGA膜的生物相容性。方法体外培养纯化成年大鼠嗅鞘细胞,接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察和细胞免疫荧光技术评估细胞在PLGA膜上的粘附和生长情况;将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其在体内的组织相容性。结果相差显微镜显示嗅鞘细胞能在静电纺丝PLGA膜上粘附和存活;细胞计数分析表明细胞增殖正常;电镜下嗅鞘细胞生长状态好;体内移植实验证实静电纺丝PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论嗅鞘细胞在静电纺丝PLGA膜上良好生长,体内移植后组织相容性好,是进行神经修复很有潜力的组织工程化神经移植物。
【关键词】：嗅鞘细胞 GDNF PLGA 静电纺丝
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 原代OECs分离、培养及鉴定15-25
• 一、材料与方法15-19
• 二、结果19-21
• 三、讨论21-22
• 参考文献22-25
• 第二部分 慢病毒转染获得高表达GDNF的嗅鞘细胞及鉴定25-37
• 一、材料与方法25-31
• 二、结果31-33
• 三、讨论33-35
• 参考文献35-37
• 第三部分 电纺PLGA膜与嗅鞘细胞生物相容性研究37-49
• 一、材料与方法37-41
• 二、结果41-44
• 三、讨论44-46
• 参考文献46-49
• 总结49-50
• 综述50-60
• 参考文献55-60
• 在读硕士期间发表论文和参加科研工作情况说明60-61
• 致谢61

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本文编号：700710