功能化氧化石墨烯和缺陷介孔二氧化硅抑制Ⅱ型糖尿病中hIAPP聚集的研究

发布时间：2017-10-11 04:36

  本文关键词：功能化氧化石墨烯和缺陷介孔二氧化硅抑制Ⅱ型糖尿病中hIAPP聚集的研究

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【摘要】：Ⅱ型糖尿病(T2DM)是蛋白错误折叠成β结构淀粉样蛋白沉淀的内分泌疾病。大量的研究表明这种蛋白沉淀的主要成分是人类胰岛淀粉样蛋白(hIAPP)。h IAPP错误折叠形成低聚物和成熟纤维的过程伴随着细胞凋亡,细胞凋亡可能是由于氧化应激,线粒体损伤或者细胞膜通透性的改变造成的。避免h IAPP形成有毒性的纤维是治疗Ⅱ型糖尿病的一个合理方法。基于Ⅱ型糖尿病的发病机理,本论文设计合成了一种氧化石墨烯负载胰岛素衍生物的纳米复合物和另外一种缺陷发光介孔二氧化硅负载h IAPP部分片段甲基化的纳米粒子,系统地研究了这两类纳米粒子在抑制h IAPP纤维化及其减少细胞毒性的作用,并深入探讨了它们抑制h IAPP聚集的作用机制。本论文一共分为三章:第一章,简单的介绍了Ⅱ型糖尿病,及其发病机理,hIAPP在发病过程的作用及hIAPP聚集机制的探讨。接着综述了各种药物及纳米材料在hIAPP聚集中的研究进展,最后阐述了本课题的选题意义及目的。第二章,我们设计合成了用聚乙二醇(PEG)和胰岛素衍生物(EALYLV)修饰的氧化石墨烯为药物的纳米复合物(nGO@PEG@E),纳米氧化石墨烯(nGO)能够吸附hIAPP单体,这样可以减少溶液中游离的h IAPP浓度达到了抑制它聚集成纤维的目的。EALYLV是胰岛素衍生物,它能够特异性的结合hIAPP,能够与hIAPP侧链上的Arg11形成一个很强的盐桥,它也能够从Arg11跨越到hIAPP残基上的Phe15阻断分子形成纤维的主要作用区域,从而抑制它的聚集。纳米复合物nGO@PEG@E不仅能够抑制hIAPP的聚集还可以保护INS-1细胞不受h IAPP毒性的影响,稳定线粒体膜电位,减少细胞内的活性氧。第三章,h IAPP是一个37个氨基酸的多肽,片段8-20,20-29和30-37有能力形成纤维。NFGAIL作为一个短的hIAPP淀粉样蛋白聚集的核,它有能力自组装成β折叠结构和有细胞毒性的纤维。NF(N-Me)GA(N-Me)IL能够特异性的结合并且抑制h IAPP的聚集。缺陷介孔二氧化硅(DLMSNs)更加有利于细胞吸收的研究。本文我们合成了壳聚糖修饰并负载了N-Me)GA(N-Me)IL的DLMSNs(DL@CS@NF),它能够抑制h IAPP的聚集,在TEM和AFM的实验中明显的可以看到经过DL@CS@NF处理后的h IAPP几乎看不见成熟的纤维,在细胞实验中DL@CS@NF能够减少hIAPP产生的细胞毒性和活性氧达到保护细胞的目的。总之,纳米粒子DL@CS@NF可以作为Ⅱ型糖尿病治疗的潜在药物。
【关键词】：Ⅱ型糖尿病 hIAPP 纳米氧化石墨烯 缺陷介孔二氧化硅 胰岛素衍生物
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 绪论11-33
• 1.1 糖尿病的介绍11
• 1.2 Ⅱ型糖尿病的发病机制11-12
• 1.3 h IAPP对Ⅱ型糖尿病的影响及其聚集机制12-14
• 1.4 影响h IAPP聚集的因素14-15
• 1.5 h IAPP可能的毒性机理15-17
• 1.6 抑制h IAPP等淀粉样蛋白聚集的药物17-21
• 1.6.1 小分子抑制剂17-18
• 1.6.2 以肽为基础的淀粉样蛋白抑制剂18-20
• 1.6.3 以抗体为基础的抑制剂20-21
• 1.7 纳米材料在抑制h IAPP聚集中的应用21-25
• 1.7.1 无机纳米粒子21-22
• 1.7.2 碳纳米材料22-24
• 1.7.3 介孔纳米材料24
• 1.7.4 磁性纳米材料24-25
• 1.8 本课题的选题意义和研究目的25-27
• 参考文献27-33
• 第二章 nGO@PEG@E纳米复合物作为Ⅱ型糖尿病中抑制h IAPP聚集的研究33-57
• 2.1 摘要33
• 2.2 引言33-34
• 2.3 实验部分34-40
• 2.3.1 实验试剂及细胞培养34-35
• 2.3.2 溶液配制35
• 2.3.3 n GO@PEG@E纳米复合物的制备35
• 2.3.4 n GO@PEG@E纳米复合物的表征35-36
• 2.3.5 h IAPP聚集体的孵育36
• 2.3.6 检测游离状态的自由h IAPP36
• 2.3.7 h IAPP浊度检测36
• 2.3.8 Th T荧光实验36-37
• 2.3.9 圆二色光谱（CD）实验37
• 2.3.10 透射电镜（TFM）37
• 2.3.11 原子力显微镜（AFM）37
• 2.3.12 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）37-38
• 2.3.13 ANS荧光发射光谱检测38
• 2.3.14 细胞毒性检测38
• 2.3.15 乳酸脱氢酶（LDH）检测38-39
• 2.3.16 细胞内活性氧（ROS）的检测39
• 2.3.17 INS-1 细胞凋亡检测39
• 2.3.18 线粒体膜电位的测定39
• 2.3.19 免疫荧光39-40
• 2.3.20 Caspase-3 活性测定40
• 2.3.21 统计方法40
• 2.4 结果和讨论40-52
• 2.4.1 n GO，n GO@PEG和n GO@PEG@E的制备和表征40-41
• 2.4.2 游离h IAPP和浊度测定法41-42
• 2.4.3 Th T检测和CD光谱检测h IAPP结构的改变42-43
• 2.4.4 TEM和AFM观察h IAPP聚集形态的变化43-45
• 2.4.5 ANS检测45-46
• 2.4.6 SDS-PAGE检测46
• 2.4.7 一种快速检测h IAPP聚集的方法[34, 35]46-48
• 2.4.8 MTT和LDH检测48-49
• 2.4.9 纳米复合物减少h IAPP多肽诱导产生的ROS49-50
• 2.4.10 纳米复合物减低h IAPP细胞毒性保护INS-1 细胞50-51
• 2.4.11 纳米复合物对h IAPP诱导线粒体膜电位的影响51
• 2.4.12 n GO@PEG@E降低caspase-3 的活性51-52
• 2.5 本章小结52-53
• 参考文献53-57
• 第三章 DL@CS@NF纳米粒子抑制h IAPP聚集及保护细胞免受h IAPP损伤的研究57-81
• 3.1 摘要57
• 3.2 引言57-59
• 3.3 实验部分59-64
• 3.3.1 实验试剂及细胞培养59
• 3.3.2 溶液配制59
• 3.3.3 h IAPP聚集体的制备59
• 3.3.4 MSNs，DLMSNs，DL@CS和DL@CS@NF的制备59-60
• 3.3.5 MSNs，DLMSNs，，DL@CS和DL@CS@NF的表征60
• 3.3.6 浊度实验检测60-61
• 3.3.7 Th T荧光实验61
• 3.3.8 透射电子显微镜（TEM）61
• 3.3.9 原子力显微镜（AFM）61
• 3.3.10 纳米粒子抑制荧光标记的h IAPP聚集61
• 3.3.11 细胞毒性检测61-62
• 3.3.12 细胞电导率的测定62
• 3.3.13 溶血实验62
• 3.3.14 Caspase-3 活性测定62
• 3.3.15 PARP裂解分析62-63
• 3.3.16 细胞内活性氧（ROS）的检测63
• 3.3.17 INS-1 细胞对DL@CS和DL@CS@NF纳米粒子的吸收63
• 3.3.18 TUNEL-DAPI染色63-64
• 3.3.19 细胞线粒体膜电位（MMDP）的检测64
• 3.3.20 统计方法64
• 3.4 结果和讨论64-76
• 3.4.1 MSNs，DLMSNs，DL@CS和DL@CS@NF的制备和表征64-66
• 3.4.2 浊度和Th T检测及纳米粒子抑制荧光标记的h IAPP聚集66-68
• 3.4.3 AFM和TEM观察纳米粒子对h IAPP形态结构的影响68-69
• 3.4.4 纳米粒子毒性检测69-71
• 3.4.5 细胞形态，Caspase-3 活性和PARP检测71-72
• 3.4.6 活性氧（ROS）检测72-73
• 3.4.7 细胞吸收实验73-74
• 3.4.8 TUNEL-DAPI共染色实验74-75
• 3.4.9 细胞内线粒体膜电位检测75-76
• 3.5 本章小结76-77
• 参考文献77-81
• 硕士期间发表的论文81-82
• 致谢82

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