柚皮苷对废用性骨质疏松的预防作用及其机制

发布时间：2017-10-11 06:36

  本文关键词：柚皮苷对废用性骨质疏松的预防作用及其机制

  更多相关文章： 废用性骨质疏松 柚皮苷 Semaphorin3A 骨膜素 β-catenin

【摘要】：目的:1.探究柚皮苷对大鼠废用性骨质疏松的预防作用。2.探究柚皮苷是否通过促进骨膜素(Periostin)和Semphorin3A(Sema3A)表达,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,从而预防废用性骨质疏松的发生。3.体外实验条件下,探究柚皮苷是否通过促进骨膜素表达,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进成骨细胞分化。方法:1.选取6个月龄雄性SD大鼠90只,随机分为5组,每组18只:正常对照组(Control),单纯骨质疏松造模组和低、中、高剂量柚皮苷预防组,后4组通过鼠尾悬吊4周建立废用性骨质疏松模型,后3组分别于造模前4周和造模后4周灌服30mg·kg-1·d-1,100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷,前2组灌服等量生理盐水。造模4周后处死取材,取各组大鼠血清进行骨代谢指标I型胶原C端肽(CTX-1)和I型前胶原氨基端肽(P1NP)检测,取各组大鼠股骨,检测股骨干和股骨颈生物力学性能,测量股骨远端骨密度(BMD),对各组大鼠股骨远端进行Micro-CT扫描、苏木素-伊红染色液(HE)染色、骨钙素(osteocalcin,OCN)免疫组化染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。2.取各组胫骨,通过RT-PCR和q RT-PCR检测胫骨中Sema3A、Neuropilin-1(NRP1)、骨膜素、骨硬化蛋白(Sclerostin)和β-catenin的m RNA水平,通过Western-blot检测Sema3A、骨膜素、骨硬化蛋白和细胞核β-catenin蛋白的表达情况,并对各组股骨行Sema3A、骨膜素和骨硬化蛋白免疫组化染色。3.体外培养小鼠成骨前体样细胞MC3T3-E1,分为空白对照组,以及0.2ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、100ng/ml柚皮苷处理组,检测各组碱性磷酸酶(ALP)的活性以筛选出促进成骨细胞分化的最佳柚皮苷浓度。相对于空白对照组,在最佳浓度柚皮苷刺激下,通过PCR检测成骨细胞分化特异性基因BMP-2、OCN和Runx2的表达情况,通过PCR和Western-blot检测Sema3A、骨膜素以及β-catenin的m RNA及蛋白的表达情况。观察骨膜素特异性抗体能否抑制柚皮苷促进成骨细胞ALP活性的上调。结果:1.造模4周后,相对于正常对照组,单纯造模组股骨力学性能和股骨远端BMD显著下降,股骨远端骨小梁微结构遭到显著破坏,单纯造模组血清P1NP显著下降,CTX-1显著上升,股骨远端成骨细胞OCN免疫组化强度显著下降,股骨远端TRAP染色显示破骨细胞数量显著增加。100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷能够显著预防悬吊引起的股骨力学性能下降和骨密度降低,并改善悬吊破坏的骨小梁微结构,中、高剂量柚皮苷能够显著上调血清P1NP水平,下调CTX-1,并显著增强股骨远端OCN的免疫组化强度,减少小梁周围破骨细胞数量。2.造模4周后,相对于正常对照组,胫骨Sema3A、骨膜素和核β-catenin的表达水平显著下降,骨硬化蛋白表达显著增加,股骨免疫组化染色显示骨外膜成骨细胞分泌的骨膜素显著减少,股骨远端成骨细胞分泌的Sema3A显著下调,股骨干骨细胞骨硬化蛋白免疫染色阳性强度显著上升。相对于单纯造模组,中、高剂量柚皮苷显著增加胫骨Sema3A、骨膜素与核β-catenin的表达水平,减少骨硬化蛋白表达,股骨免疫组化染色显示骨外膜成骨细胞分泌的骨膜素显著增加,股骨远端成骨细胞分泌的Sema3A显著上调,股骨干骨硬化蛋白免疫染色阳性强度显著下降。3.相对于空白对照组,20ng/ml柚皮苷促进成骨细胞分化的能力最强,20ng/ml柚皮苷显著促进BMP-2、OCN、Runx2、Sema3A、骨膜素、Nrp1和β-catenin的m RNA的表达,Western-blot结果显示20ng/ml柚皮苷显著增加Sema3A、骨膜素和核β-catenin蛋白的表达。骨膜素特异性抗体能够抑制20ng/ml柚皮苷对成骨细胞分化的促进作用。结论:1.柚皮苷具有促进骨形成并抑制骨重吸收的双重作用,能够预防大鼠废用性骨质疏松的发生。2.柚皮苷可能是通过上调骨膜素,进而下调骨硬化蛋白,从而激活Wnt/β-catenin信号通路,以及上调Semaphorin3A进而激活Wnt/β-catenin信号通路这两条信号路径促进骨质合成。3.柚皮苷可能通过上调成骨前体样细胞中骨膜素的表达,以自分泌或旁分泌的方式激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进成骨细胞分化。
【关键词】：废用性骨质疏松 柚皮苷 Semaphorin3A 骨膜素 β-catenin
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、柚皮苷对废用性骨质疏松的预防作用17-36
• 1.1 对象和方法17-25
• 1.1.1 实验动物及分组17-18
• 1.1.2 实验材料与试剂18
• 1.1.3 实验仪器18
• 1.1.4 常用溶液配制18-19
• 1.1.5 实验方法19-25
• 1.1.6 统计学分析25
• 1.2 结果25-30
• 1.2.1 柚皮苷对失力学载荷下股骨远端骨密度的影响25
• 1.2.2 柚皮苷对失力学载荷下股骨生物力学性能的影响25-26
• 1.2.3 柚皮苷对失力学载荷下股骨远端干骺端骨小梁微结构的影响26-28
• 1.2.4 各组股骨远端HE染色结果28
• 1.2.5 柚皮苷对各组血清中骨转换指标的影响28-29
• 1.2.6 柚皮苷对骨小梁局部成骨细胞和破骨细胞分化的影响29-30
• 1.3 讨论30-35
• 1.3.1 废用性骨质疏松的治疗现状30-32
• 1.3.2 柚皮苷对废用性骨质疏松的预防效果32-35
• 1.4 小结35-36
• 二、柚皮苷预防废用性骨质疏松发生的分子机制36-57
• 2.1 对象和方法36-45
• 2.1.1 实验动物与分组36
• 2.1.2 实验材料及试剂36-37
• 2.1.3 实验仪器37-38
• 2.1.4 常用溶液配制38
• 2.1.5 实验方法38-45
• 2.1.6 统计学分析45
• 2.2 结果45-51
• 2.2.1 柚皮苷对各组胫骨Wnt/β-catenin信号通路活性的影响45-46
• 2.2.2 柚皮苷对Postn，，Sost的mRNA表达的影响46-47
• 2.2.3 各组骨膜素和骨硬化蛋白在蛋白水平的表达情况47-49
• 2.2.4 柚皮苷对Sema3a，Nrp1的mRNA表达的影响49-50
• 2.2.5 各组Sema3A在蛋白水平的表达情况50-51
• 2.3 讨论51-56
• 2.3.1 Wnt/β-catenin信号通路失活导致骨质疏松的发生51-53
• 2.3.2 骨膜素通介导柚皮苷对Wnt信号通路的激活53-54
• 2.3.3 Sema3A介导柚皮苷对Wnt信号通路的激活54-56
• 2.4 小结56-57
• 三、柚皮苷通过激活Wnt信号通路促进成骨细胞分化57-70
• 3.1 对象和方法57-63
• 3.1.1 细胞来源57
• 3.1.2 实验材料及试剂57-58
• 3.1.3 实验仪器58
• 3.1.4 实验试剂和常用溶液配制58-60
• 3.1.5 实验方法60-63
• 3.1.6 统计学分析63
• 3.2 结果63-67
• 3.2.1 MC3T3-E1细胞形态63
• 3.2.2 柚皮苷对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响63-64
• 3.2.3 柚皮苷对成骨细胞分化特异性基因表达的影响64-65
• 3.2.4 柚皮苷对Postn，β-catenin和Sema3a的mRNA的表达影响65
• 3.2.5 柚皮苷对骨膜素、Sema3A及核 β-catenin蛋白的表达影响65-66
• 3.2.6 骨膜素抗体对各组细胞ALP活性的影响66-67
• 3.3 讨论67-69
• 3.3.1 柚皮苷对成骨细胞和破骨细胞分化的影响及其机制67-68
• 3.3.2 柚皮苷通过促进骨膜素表达促进成骨细胞分化68-69
• 3.4 小结69-70
• 结论70-71
• 参考文献71-77
• 发表论文和参加科研情况说明77-78
• 综述 柚皮苷防治骨质疏松的研究现状78-89
• 综述参考文献84-89
• 致谢89-90
• 个人简历90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：1011025