iTRAQ联合质谱技术筛选慢性氟中毒大鼠骨组织差异蛋白及生物信息学分析

发布时间：2017-10-14 17:04

  本文关键词：iTRAQ联合质谱技术筛选慢性氟中毒大鼠骨组织差异蛋白及生物信息学分析

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【摘要】：目的:采用iTRAQ定量蛋白质组学技术,比较不同剂量氟中毒大鼠及对照组大鼠骨组织的蛋白表达差异,获得氟中毒大鼠骨组织中差异表达蛋白。通过生物信息学分析鉴定这些差异表达蛋白,并分析蛋白相互作用及可能参与的信号通路,为揭示氟骨症发生的分子机制提供科学依据。方法:1.慢性氟中毒大鼠模型的建立与验证:48只健康SD大鼠随机分为4组,对照组饮用自来水,低氟组、中氟组、高氟组分别饮用含50、150、250 mg/L氟化钠的自来水。饲养6个月后,检测氟斑牙发生率,氟离子选择电极法检测各组大鼠尿氟、骨氟、牙氟、血清氟含量;取大鼠股骨干骺端进行石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色、光镜观察,骨组织形态学计量染氟大鼠骨组织形态学改变;酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清骨代谢标志物含量。2.采用iTRAQ联合质谱技术筛选差异蛋白:提取四组大鼠骨匀浆蛋白酶解为肽段,以iTRAQ试剂标记,经过强阳离子SCX交换,反相液相色谱分离,质谱鉴定和蛋白检索后得到差异蛋白;对差异蛋白进行GO分析、KEGG pathway分析、STRING分析等生物信息学方法进行分析,寻找差异蛋白显著相关的生物学功能,参与的代谢通路和信号转导途径,分析蛋白-蛋白互相作用网络;筛选出关键蛋白MMP8(基质金属蛋白酶)、CRT(钙网织蛋白)。3.免疫组织化学染色法验证MMP8、CRT的表达:取大鼠骨组织石蜡切片,免疫组化超敏二步法染色观察MMP8、CRT在股骨组织中的表达,IPP软件测定平均光密度验证蛋白表达水平。结果:1.慢性氟中毒大鼠模型建立及验证:(1)氟斑牙发生情况与氟负荷量的变化:各染氟组大鼠氟斑牙检出率、尿氟、骨氟和血清氟含量均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),而且随染氟剂量增高,氟斑牙严重程度、尿氟、骨氟、牙氟和血氟呈上升趋势。(2)大鼠股骨组织形态计量学结果:中、高氟组大鼠的骨皮质厚度均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);低氟组骨小梁平均面积小于对照组,差异有统计学意义(P0.05);低中高氟组成骨细胞数均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。BGP、BALP、PⅠNP检测结果:低氟组与对照组比较呈下降趋势,BALP有显著差异(P0.01),中、高氟组BGP、BALP含量小于对照组,差异有统计学意义(P0.05);CTX-Ⅰ、TRACP-5b检测结果:低中、高氟组TRACP-5b含量均小于对照组,中、高氟组CTX-Ⅰ小于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。2.鉴定到显著性差异蛋白质63个:(1)相对于正常组,低氟组差异蛋白共13个,中氟组差异蛋白共35个,高氟组差异蛋白共33个;(2)差异蛋白参与的生物学过程有37种、细胞组分有39种、分子功能有40种;(3)参与的相关信号通路15条。(4)差异蛋白质内部构建了基因网络关系图,51个蛋白质的基因都有直接或间接的联系。3.免疫组化验证MMP8与CRT表达:(1)低氟组、中氟组、高氟组的骨细胞MMP-8的IOD值均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);低氟组成骨细胞MMP-8的IOD值高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。(2)中氟组软骨细胞CRT的IOD值低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);低氟组成骨细胞CRT的IOD值低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1成功构建慢性氟中毒大鼠模型;骨组织形态计量及骨代谢标志物检测结果提示氟对成骨活性与破骨活性均有影响,且与染氟剂量有关。2、63个显著差异蛋白、15条相关通路、51个互相作用蛋白可能直接或间接地参与了慢性氟中毒骨相损害分子机制。3.MMP8与CRT表达水平与蛋白质组学结果一致,MMP-8和CRT的表达变化可能与氟性骨损伤的发生发展密切相关。
【关键词】：iTRAQ 蛋白组学 氟中毒 差异蛋白 生物信息学
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R599.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 英文缩略词表11-13
• 引言13-19
• 第一部分 慢性氟中毒大鼠实验模型的建立与验证19-39
• 材料与方法19-27
• 结果27-35
• 讨论35-39
• 第二部分 基于iTRAQ结合 2D LC-MS/MS技术鉴定氟中毒大鼠骨组织的差异蛋白及生物信息学分析39-63
• 材料与方法39-49
• 结果49-58
• 讨论58-63
• 第三部分 差异蛋白MMP-8 与CRT的验证63-71
• 材料与方法63-65
• 结果65-69
• 讨论69-71
• 结论71-72
• 参考文献72-79
• 附录79-87
• 综述87-96
• 参考文献93-96
• 作者简历96-97
• 致谢97-98
• 学位论文数据集98

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3 张t，

本文编号：1032133