白藜芦醇对低浓度过氧化氢促进滑膜细胞增殖的凋亡诱导作用和可能机制

发布时间：2017-10-16 05:04

  本文关键词：白藜芦醇对低浓度过氧化氢促进滑膜细胞增殖的凋亡诱导作用和可能机制

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【摘要】：背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)属于免疫性疾病,其发病机制迄今尚未完全明了,传统的非甾体类抗炎药等的治疗,虽可以有效减缓病情,但不能从本质上改变RA患者的关节结构破坏,更不能彻底解决患者的病情发展问题。RA患者关节滑膜细胞过度增殖,对滑膜下软骨的侵蚀可能是其致病重要的一个原因。从生理功能来看,关节滑膜可以产生滑液,起到润滑关节、供给关节营养的作用,除此之外,关节滑膜还具有排除多余的滑液,排出脱落的软骨碎屑等功能。然而,由于疾病原因所导致的滑膜组织异常增生,其异常组织则类似局限性侵袭生长的肿瘤组织,会进行性、持续性破坏关节骨性结构,继而发生关节致畸,同时伴随关节不同程度功能障碍。作为滑膜组织中的重要组分,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)在关节破坏过程中,其作用举足轻重,它可以分泌多种细胞因子、花生四烯酸代谢产物、炎性介质等,参与整个破坏过程。大量研究文献证实显示,FLS的增殖在RA的发病和病程进展中起到重要作用。RA患者的FLS失控性生长,具有异常增殖和侵蚀特性。研究表明,在RA关节滑膜的炎性病变中,活性氧(reactive oxygen species, ROS)参与了骨质的损伤。研究证实,Forkhead boxO (FoxOs)是具有种属特异性的Forkhead转录因子亚家族,具有敏感的氧化还原反应作用,参与控制和调节细胞的增殖、活化和氧化过程,在调控机体代谢、细胞的增殖、氧化还原中起重要作用的基因,在细胞内活性氧稳态的维持过程中作用显著,可增加细胞内的抗氧化能力保护细胞免受氧化损害。既往研究显示,Bcl-2是定位于线粒体膜和内质网膜上的抗凋亡蛋白,Bax基因转录物广泛存在于体内各组织中,胞质中的Bax蛋白从胞质转位凋亡信号至线粒体膜上,激活caspase进而诱导细胞凋亡。非黄酮的多酚类化合物白藜芦醇(resveratrol, RES)是研究较多的一类植物抗毒素,具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤作用等作用,对于相关代谢性疾病---RA的治疗价值是当前医学研究的热点。目的 动物模型采用弗氏完全佐剂,制备佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠,评价AA大鼠建模情况。通过体内实验,观察AA大鼠的氧化应激情况,以及RES治疗情况；体外培养滑膜细胞,探讨研究RES对过氧化氢(H202)处理的大鼠AA-FLS凋亡的影响,分析各组FLS中FoxO1、FoxO4基因水平的表达,并探讨Fox基因在其凋亡过程中的作用。方法 90只SD大鼠,随机分为正常组、模型组、白藜芦醇(低剂量1 μmol/L、中剂量5μmol/L、高剂量20 μmol/L)给药组、阳性药组(NAC),每组15只。采用弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant, FCA),通过皮下给药法,注射大鼠足趾部位,诱导SD大鼠建立AA大鼠动物模型,14d成模后,连续给予SD大鼠采用灌胃法(intragastric administration, ig)白藜芦醇12d,采用多发性关节炎指数、关节肿胀度、体重等多方面综合指标的变化,进行FCA诱导大鼠AA模型的原发、继发情况评价。第26天,股动脉放血处死大鼠,取血,分光光度计检测各组大鼠机体的氧化应激情况丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力。体外实验,取致炎侧踝关节滑膜组织,应用组织块培养法分离培养大鼠膝关节滑膜细胞,取培养第3代FLS用于实验, (1)FLS分离鉴定：采用免疫细胞荧光染色,兔抗鼠VCAM-1多克隆抗体鉴定滑膜细胞； (2)细胞增殖实验：采用CCK-8法观察不同浓度的1-1202对FLS的增殖的影响；(3)细胞凋亡检测：Annexin V-FITC-PI流式细胞术检测不同浓度的RES对H2O2(20μmol/L)处理FLS的细胞凋亡率； (4)机制探讨：采用RT-PCR检测各组FLS中FoxO1、FoxO4基因水平的表达,探讨其诱导滑膜组织凋亡的内在联系；Western blot检测分析FLS中Bcl-2、Bax蛋白表达变化情况,运用细胞生物学和分子生物学等技术,进一步从细胞凋亡学角度阐明白藜芦醇治疗RA的作用机理。结果 体内实验证实AA大鼠经FCA皮下注射法注射足趾部位,诱导关节炎14天后,AA大鼠足趾出现继发性免疫炎症反应,RES可有效减轻AA大鼠继发性足肿胀、多发性关节炎指数、体重下降。血清学检测结果表明模型组大鼠较正常组大鼠模型组SOD活力降低,MDA水平升高,与模型组比较,RES各治疗组及NAC阳性对照组均能升高SOD水平,并降低MDA水平,以RES中、高剂量组具显著意义(P0.05,P0.01)。体外实验结果表明,CCK-8法观察显示,H2O2 (≤20μmol/L)在一定浓度范围内,可以促进FLS生长,而当H2O2 (20μmol/L)时,H202诱导的FLS凋亡数则会明显增高,低剂量H2O2可促进FLS增殖,白藜芦醇可促进低剂量H2O2诱导的FLS凋亡作用；Annexin V-FITC-PI流式细胞术检测发现,在低浓度H2O2氧化应激刺激下,FLS的细胞凋亡率会随着RES浓度的升高,出现明显的升高；采用RT-PCR检测出,RES明显降低FoxO1、FoxO4基因水平的表达,FLS凋亡与某些FoxOs基因表达下调相关,RES通过降低FLS内FoxO1、FoxO4基因相对表达而实现凋亡诱导作用。Western blot检测分析发现,随着RES浓度的升高,Bcl-2表达显著降低,促凋亡蛋白Bax表达逐渐升高。结论 白藜芦醇可有效改善AA大鼠的关节炎症状,降低AA大鼠血清过氧化情况。机制研究表明,RES通过下调FoxO1、FoxO4基因、抗凋亡Bcl-2蛋白,抑制Bax蛋白表达诱导滑膜细胞的凋亡。RES抑制AA大鼠FLS增生,促进FLS凋亡,实现其治疗目的；RES可通过调节凋亡蛋白Bcl-2/Bax相对表达诱导滑膜细胞凋亡, 同时,可通过调节凋亡蛋白实现促进FLS凋亡的作用,降低Bcl-2蛋白表达、升高Bax表达可能是其促进凋亡作用中的一个机制。
【关键词】：白藜芦醇 过氧化氢 滑膜细胞 凋亡 FoxO基因 Bc1-2/Bax蛋白
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 英文缩略词表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-16
• 1 引言16-18
• 2 材料18-23
• 2.1 动物18-19
• 2.2 实验主要仪器与设备19-20
• 2.3 试剂20-21
• 2.4 主要试剂配制21-23
• 3 实验方法23-32
• 3.1 RES对大鼠AA模型的影响23
• 3.2 RES对AA大鼠继发性炎症的影响23-26
• 3.3 AA大鼠踝关节滑膜细胞的采集、培养与鉴定26-27
• 3.4 RES体外给药对AA大鼠免疫功能的影响27-32
• 4 结果32-43
• 4.1 RES对AA大鼠继发性炎症的影响32-36
• 4.2 RES对AA大鼠膝关节形态学实验结果36-38
• 4.3 H_2O_2对FLS增殖的影响38-39
• 4.4 RES增加H_2O_2诱导的FLS细胞凋亡39-40
• 4.5 RES下调低浓度H_2O_2诱导的FLS的Fox01、Fox04基因表达40-42
• 4.6 RES对H_2O_2诱导的FLS的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响42-43
• 5 讨论43-46
• 6 结论46-48
• 参考文献48-56
• 附录 个人简历56-57
• 致谢57-58
• 综述58-68
• 参考文献64-68

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本文编号：1040749