NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞抑制的挽救效应

发布时间：2017-10-24 02:13

  本文关键词：NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞抑制的挽救效应

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【摘要】：目的本研究利用细胞核因子κB受体活化因子配体(Ligand of receptor activator of nuclear factorκB,RANKL)诱导小鼠白血病单核巨噬细胞RAW264.7细胞系向破骨细胞分化。在此过程中加入第三代双膦酸盐—唑来膦酸,探索唑来膦酸对破骨细胞生成的抑制作用和对破骨细胞的主要调节因子活化T细胞核因子蛋白c1(nuclear factor of activated T cells type c1,NFATc1)及其下游因子表达的影响;利用慢病毒载体构建鼠源NFATc1重组载体、人源结构活性NFATc1重组载体,证实NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞抑制的挽救效应。方法1建立小鼠白血病单核巨噬细胞RAW264.7细胞系体外培养体系;将细胞分为2组:A组为对照组,B组为唑来膦酸处理组;两组细胞用50ng/ml RANKL诱导5天,并且第2天在B组中加入1×10-6mmol/ml唑来膦酸作用两天。在第6天收获两组细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和牙本质陷窝检测破骨细胞的生成和骨吸收功能。NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表达和m RNA水平则通过Western-Blot、免疫荧光化学和Real-time PCR检测。2利用慢病毒构建鼠源NFATc1重组载体和人源结构活性的NFATc1(constructive active NFATc1,ca-NFATc1)重组载体,并且利用阴性载体慢病毒转染RAW264.7细胞确定转染时的最佳MOI值。随后应用NFATc1重组载体转染RAW274.7细胞,NFATc1过表达的蛋白表达量和m RNA水平分别通过WesternBlot、Real-time PCR检测。3将RAW264.7细胞分为三组:其中A组为对照组;B组为阴性载体转染组;C组为NFATc1重组载体转染组。三组细胞应用与上述相同的处理方法,RANKL和唑来膦酸作用5天。第六天收获3组细胞,进行如下检测:TRAP染色、Western-Blot、Real-time PCR、免疫荧光化学及牙本质吸收陷窝,以此来证实NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞抑制的挽救效应。结果1成功构建RAW264.7细胞系体外培养体系。经RANKL和唑来膦酸处理后,A、B两组细胞中均出现多核破骨细胞;其中B组(唑来膦酸处理组)中破骨细胞数目、骨吸收陷窝数目及骨吸收陷窝面积分别为24.5±2.1、22.3±3.1和5746.0±786.6mm2,均显著低于A组中55.0±3.0、32.7±2.5和9054.7±182.5mm2(P0.05)。经Western-Blot检测,B组中NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表达显著低于A组(P0.05),分别下降了44.1%、37.9%和35.8%;经Real-time PCR检测,B组中3种基因的m RNA水平较A组也显著降低,分别下降了50.5%、49.5%、45.5%(P0.05);免疫荧光细胞化学检测也得到与上述相似的结果,B组中NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表达明显低于A组。上述结果提示,唑来膦酸对破骨细胞的生成起到抑制作用,并且能够下调破骨细胞相关基因(NFATc1、TRAP、c-Src)的表达。2委托上海吉凯基因有限公司成功构建鼠源NFATc1重组载体和人源ca-NFATc1重组载体。转染时最佳的MOI值为30,此时能够获得较高的转染效率,细胞能有较高的活性以及增殖能力。鼠源NFATc1重组载体:经Western-Blot检测,C组NFATc1、TRAP蛋白表达量较A组中升高了178.6%、127.8%(P0.01);经Real-time PCR检测,C组NFATc1、TRAP m RNA水平较A组中也升高了41.9%、33.6%(P0.05);B组中NFATc1的蛋白表达量和m RNA水平与A组无明显差别(P0.05)。转染人源ca-NFATc1重组载体后也得到与鼠源组相似的结果。3尽管三组同样应用RANKL和唑来膦酸处理,。C组中TRAP阳性破骨细胞的数目、牙本质吸收陷窝数和吸收陷窝的面积分别是71.0±4.6、42.3±1.5和11863.7±968.1mm2明显高于A组(27.0±1.0、23.0±1.7和6024.0±270.8mm2)(P0.01)。转染鼠源NFATc1的C组中NFATc1、TRAP、cSrc的蛋白表达量经Western-Blot检测与A组相分别上升了92.0%、90.2%和122.0%(P0.01);Real-time PCR检测显示,C组NFATc1、TRAP、c-Src m RNA水平较A组分别升高了70.2%、71.7%和69.2%(P0.01)。然而,B组中以上参数与A组无明显区别(P0.05)。转染人源ca-NFATc1重组载体后NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表达量和m RNA水平亦获得与以上相似的结果。以上结果均提示,外源性NFATc1过表达能够在一定程度上对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成的抑制和一些破骨细胞相关基因表达的抑制产生挽救效应。结论唑来膦酸能够抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化,并且抑制NFATc1、TRAP和c-Src等破骨细胞相关基因的表达;成功构建NFATc1过表达重组载体,并促进了下游因子TRAP的表达;NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成、骨吸收功能及NFATc1、TRAP、c-Src基因表达的抑制产生挽救效应。NFATc1作为Ca2+信号轴的关键调节因子和破骨细胞分化主要调节基因,在唑来膦酸对破骨细胞的生成抑制中起到关键作用。
【关键词】：唑来膦酸 破骨细胞 活化T细胞核因子蛋白c1 基因重组
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-55
• 1.1 材料13-14
• 1.1.1 实验对象13
• 1.1.2 仪器和设备13
• 1.1.3 试剂和药物13-14
• 1.2 实验方法14-27
• 1.2.1 小鼠RAW264.7 细胞的培养14-15
• 1.2.2 唑来膦酸对破骨细胞生成、功能及NFATc1、TRAP、c-Src表达的影响15-23
• 1.2.3 NFATc1过表达重组载体构建23-26
• 1.2.4 NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成、功能及NFATc1、TRAP、c-Src表达抑制的影响26-27
• 1.2.5 统计分析27
• 1.3 结果27-48
• 1.3.1 小鼠RAW264.7 细胞的培养27-28
• 1.3.2 唑来膦酸对破骨细胞生成及NFATc1、TRAP、c-Src表达的影响28-32
• 1.3.3 NFATc1过表达重组载体构建32-40
• 1.3.4 NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成、功能及NFATc1、TRAP、c-Src表达抑制的影响40-48
• 1.4 讨论48-51
• 1.4.1 唑来膦酸对破骨细胞抑制的分子机制48
• 1.4.2 唑来膦酸对破骨细胞形成及NFATc1、TRAP、c-Src表达的影响48-50
• 1.4.3 NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞抑制的影响50-51
• 1.5 小结51
• 参考文献51-55
• 第2章 综述 NFATc1在破骨细胞分化过程中的重要作用55-61
• 2.1 破骨细胞55
• 2.2 唑来膦酸对破骨细胞的抑制作用55-56
• 2.3 Ca2+/Calmodulin/ NFATc1信号途径56-57
• 2.4 活化T细胞核因子蛋白（nuclear factor of activated T cells，NFAT）57-58
• 2.4.1 NFAT的生物学特性和分类57
• 2.4.2 NFATc1在破骨细胞分化中的重要作用57-58
• 参考文献58-61
• 结论61-62
• 附录A 鼠源NFATc1重组质粒测序结果62-64
• 附录B 人源ca-NFATc1重组质粒测序结果64-66
• 致谢66-67
• 导师简介67-68
• 作者简介68-69
• 学位论文数据集69

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