非天然氨基酸插入法构建RANKL疫苗对小鼠胶原诱导型关节炎的治疗

发布时间：2017-11-12 06:44

  本文关键词：非天然氨基酸插入法构建RANKL疫苗对小鼠胶原诱导型关节炎的治疗

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【摘要】：类风湿性关节炎是一种以关节病变为主的慢性全身自身免疫性疾病。主要临床表现为小关节的滑膜炎所致的关节肿痛,继而关节软骨破坏、关节骨侵蚀,晚期因严重的骨质破坏导致关节的僵直、畸形、功能丧失。全身骨量减少导致的病理性骨折是类风湿关节炎最严重的关节外表现。慢性炎症刺激的破骨细胞骨吸收活动的过度增强是导致骨破坏的主要病理机制。OPG/RANKL-RANK信号通路是机体控制破骨细胞分化成熟和功能的关键信号通路,核因子kB受体活化因子配体(RANKL)通过与核因子kB受体活化因子结合后,通过经典的丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPKs),PI3K/AKT和NFkB等信号通路来激活下游的破骨细胞相关基因,从而启动破骨细胞的分化与成熟。而骨保护素OPG作为RANKL的诱骗受体,竞争性阻断RANKL与RANK的结合来抑制破骨细胞的分化、成熟及骨吸收作用。近年来研究表明,抗RANKL抗体可以特异性阻断RANKL与其受体RANK的结合,从信号转导途径的上游阻断破骨分化信号的发放,在骨质疏松等破骨细胞骨吸收过强的疾病中起到了很好的治疗作用。然而,单克隆抗体高昂的造价和安全性隐患限制了其广泛的临床应用。相对于单克隆抗体,通过研制针对自体蛋白疫苗来诱导机体产生特异性的多克隆抗体则显得更为经济和安全。研究发现,非天然氨基酸插入法是解决自体蛋白免疫耐受的新策略。通过在自体蛋白的特定位点插入非天然氨基酸,以增强自体蛋白的免疫原性,使自体免疫耐受被突破,从而产生高滴度的针对自体蛋白的多克隆抗体。本实验中利用非天然氨基酸插入法这一全新的技术对RANKL进行特定位点的非天然氨基酸插入修饰,构建非天然氨基酸替代的小鼠RANKL重组蛋白疫苗(pNO_2Phe~(240)mRANKL),并在小鼠胶原诱导型关节炎模型中检测其疗效与可行性,为进一步优化疫苗治疗类风湿性关节炎奠定了基础。【方法和结果】1、通过对pET28a-mRANKL重组表达载体进行240位点p-硝基苯丙氨酸突变,构建pET28a-pNO_2Phe~(240)mRANKL突变重组载体。通过原核表达系统野生型和突变重组蛋白表达和纯化。表达序列和蛋白分别通过双向测序和质谱分析鉴定。2、分别用pNO_2Phe~(240)mRANKL突变重组蛋白与野生型mRANKL蛋白免疫DBA1小鼠以检测自身抗体诱导水平。在免疫结束后第7天,取小鼠血清,用ELISA检测抗WT mRANKL和pNO_2Phe~(240)mRANKL的抗体滴度。结果表明抗血清具有较高的效价(1:6400)。3、验证p-硝基苯丙氨酸-RANKL重组疫苗对小鼠胶原诱导型关节炎的治疗效应。在疫苗蛋白免疫结束后的第7天开始对DBA1小鼠尾部皮下注射II型胶原蛋白诱导关节炎模型。通过临床关节炎评分,血清二型胶原抗体的滴度和组织病理切片等实验方法评估关节炎炎症的程度;X线平片扫描技术和显微CT技术检测骨局部和全身骨侵蚀的程度。结果显示突变重组蛋白对小鼠关节对骨侵蚀有明显的治疗效果,且在减轻关节炎表征上有一定的作用。【结论】本课题首次构建了非天然氨基酸插替代的pNO_2Phe~(240)mRANKL重组蛋白疫苗并在小鼠胶原诱导型关节炎模型上验证其治疗作用。对关节炎临床表征和侵蚀的结果分析表明,非天然氨基酸突变疫苗免疫的小鼠的骨侵蚀程度被明显的降低,同时,关节炎表现也有一定的降低,与预期相一致。为下一步疫苗的优化和其机制的深入研究打下了基础。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22

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本文编号：1174791