毒死蜱吸入暴露染毒致脑损伤效应及作用机制研究

发布时间：2017-11-19 09:28

  本文关键词：毒死蜱吸入暴露染毒致脑损伤效应及作用机制研究

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【摘要】：研究目的:建立全身动态暴露毒死蜱(Chlorpyrifos,CPF)吸入染毒致大鼠认知障碍模型,规范CPF气溶胶粒径及浓度,真实模拟CPF急性吸入染毒状态,确定半数致死浓时积(Median lethal concentration×time,LCt50);观察病理、行为学、AChE、ACh、氨基酸类神经递质及炎性反应相关因子等在CPF染毒后不同时间、不同脑区的变化;评价不同类型抗炎药物对CPF中毒所致认知障碍及脑损伤的预防作用,探讨CPF中毒引发乙酰胆碱酯酶、神经递质及炎性反应变化与中毒引发脑损伤的相关性。研究方法:1、CPF吸入染毒模型建立及LCt50确定。通过优化气溶胶发生参数,建立动物急性吸入CPF的动态暴露环境;利用吸附采样-气相检测技术监测暴露舱内CPF浓度,利用粒径监测仪实时监测暴露舱内CPF粒径,同时考察浓度、粒径随时间的变化;将50只SPF级雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,置于染毒环境中进行染毒,染毒时间分别为5、7、10、14、20 h,观察染毒过程中动物症状,记录染毒后各剂量组10天内的动物死亡情况,采用Bliss法计算确定LCt50。2、CPF染毒后行为学及不同脑区病理学变化。取100只大鼠进行Morris水迷宫训练,检测空间学习记忆能力。训练结束后,取50只作为实验组,将其随机分为5组,每组10只,以0.4 LCt50 CPF的剂量进行全身暴露染毒;剩余50只作为对照组,正常暴露于相同条件下的空气中,分别在染毒后1d、2d、3d、7d及14d各取10只大鼠,进行水迷宫实验,实验结束后观察不同脑区病理学变化。3、CPF染毒后不同时间AChE、ACh及氨基酸类神经递质变化。将280只SD雄性大鼠随机分为4组,每组70只,分别暴露于0、0.2、0.4、0.8倍LCt50剂量下进行全身暴露动态吸入CPF,分别在染毒后10min、3h、8h、1d、2d、3d和7d取5只大鼠,尾静脉采血,采用酶联免疫分析法,测定海马、纹状体及额叶皮层区AChE的表达变化;采用高效液相色谱法,测定ACh、Glu、Asp、Gly及GABA的含量变化。4.CPF染毒后不同时间炎性因子表达变化。将30只SD雄性大鼠随机分为6组,每组5只,以0.4 LCt50 CPF的剂量进行全身暴露动态染毒。采用实时荧光定量PCR法,分别在染毒后30min、3h、8h、24h、3d及7d等不同时间点,测定额叶皮层及海马组织IL-1β、TNF-α及NF-κB的表达变化。5.不同类型抗炎药物对CPF染毒所致认知障碍及脑损伤的保护作用。将25只大鼠随机分为5组,每组5只,在染毒前30min分别尾静脉注射tnf-α特异性拮抗剂(益赛普,3mg/kg)、nf-κb特异性拮抗剂(pdtc,2mg/kg)、广谱抗炎药(布洛芬,10mg/kg)及生理盐水。以0.4lct50毒死蜱的剂量进行全身暴露动态染毒后3d,取出完整右脑进行he染色,剩余完整左脑分离出额叶皮层及海马组织测定炎性反应相关因子il-1β、tnf-α及nf-κb的表达变化,评价不同抗炎药物对cpf所致认知障碍及脑损伤的预防作用。研究结果:1、本实验中气溶胶粒子平均值(1.3μm)、众数值(1.3μm)、几何平均值(1.1μm)相近,且分布符合正态分布规律,符合oecd403/433急性吸入毒性实验指导原则要求。暴露舱内气溶胶浓度随时间的变化保持稳定(160.6±11.1mg/m3),变异系数(rsd)在7%之内,提示暴露舱内气溶胶浓度稳定;在此浓度条件下,大鼠吸入暴露cpflct50为1654.3mg/m3·h,lct95为3015.6mg/m3·h;2、cpf吸入染毒后动物在1w内出现了短期的空间记忆障碍,病理学观察可见海马及额叶皮层区出现神经元核固缩、形成结节或坏死,但纹状体区未见明显病理学改变;3、cpf吸入染毒后动物海马区及额叶皮层区ache活性在染毒后30min出现了明显下降(p0.05),并在24h达到最低,随后表现为缓慢回升,在染毒后3d较正常值仍有显著性差异(p0.05),至染毒后7d恢复正常水平;而纹状体区ache变化滞后,在染毒后24h才出现明显下降(p0.05),3d时较正常值已无显著性差异;4、全身暴露染毒后不同脑区ach与染毒浓度密切相关,各脑区在染毒后24h时普遍达到峰值,之后呈现下降趋势。其中,海马及额叶皮层区染毒后ach在染毒后3d较正常组仍有显著性差异(p0.05),7d时趋于正常水平;而低剂量组纹状体区ach在染毒后2d即趋于正常水平,中剂量及高剂量组在染毒后3d趋于正常水平;5、全身暴露染毒后不同脑区氨基酸类神经递质与染毒浓度密切相关。高浓度染毒组动物海马区eaas在染毒后30min时就出现了明显升高(p0.05);中浓度染毒组在染毒后glu在30min首先出现了明显升高(p0.05),并在48h达到表达最高值(p0.01),而asp在3h出现了明显升高(p0.05),在24h达到最高;低浓度组asp在染毒后8h达到表达最高值(p0.05),而glu将持续升高至24h达到表达最高值(p0.05)。高浓度及中浓度染毒组动物海马eaas在染毒后7d较正常水平仍有显著性差异(p0.05),而低浓度组在染毒后1-2d即趋于正常水平。额叶皮层区eaas有类似变化规律,并高出海马区eaas含量一半左右,低浓度组动物eaas升高持续时间更长,直到染毒后3d趋于正常水平。纹状体区变化最小,变化规律类似于海马区。iaas变化规律类似于eaas。不同的是,高、中浓度染毒动物iaas含量在染毒后7d已趋于正常水平;6、全身暴露染毒后动物海马区il-1βmrna表达含量在染毒后30min首先出现了明显的表达增加(p0.05),tnf-αmrna在染毒后3h也出现明显的表达增加(p0.05),而NF-κB mRNA增长缓慢,直到8h才表现出显著增长(P0.05);IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA表达均在染毒后48h达到峰值(P0.01),至染毒后7d表达仍明显高于染毒前水平(P0.05);额叶皮层区三种炎性因子表达总体与海马存在类似的变化趋势。不同的是,与正常对照组比较,额叶皮层区IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA在染毒后30min已出现了明显的表达增加(P0.05);7、PDTC预防给药组动物海马CA1区损伤程度有所减轻,表现为部分神经元细胞核肿胀深染,个别伴有纤维缠结,海马区可见少量小胶质细胞浸润;布洛芬预防给药组动物海马CA1区损伤程度亦有所减轻,表现为有少量神经元细胞核固缩深染,伴有少量纤维缠结;相对于PDTC及布洛芬预防给药组,益赛普预防给药组海马CA1区损伤程度更轻,细胞核质清晰,仅见个别神经元细胞核深染,细胞结构基本正常;而PDTC及益赛普预防给药组动物额叶皮层区损伤程度有所减轻,表现为部分神经元纤维缠结,细胞深染;布洛芬预防给药组动物额叶皮层区损伤程度有所减轻,但局灶性细胞固缩深染,细胞排列紊乱,仍有形成结节的趋势。结论:本实验建立了CPF气溶胶吸入染毒模型,研究结果表明动物在CPF全身暴露染毒后,1w内出现短期的空间记忆障碍。在染毒后最初几个小时,在受影响的脑区如海马及额叶皮层组织内突触ACh的快速蓄积引起严重的兴奋性毒性和胆碱能神经元的功能障碍,破坏了细胞内胆碱能通路的完整性,这种兴奋性毒性同样打破了谷氨酸能和GABA能活性的平衡,引起神经元兴奋性毒性损伤及炎症反应。这种胆碱能神经元兴奋性毒性的后果,包括广泛的细胞内水肿、核固缩、EAAs增加的兴奋性毒性、炎性因子表达上调的神经炎症和应激反应,并导致随后的各种负效应,引起大脑神经元损伤和死亡。其中基于炎性反应的干预措施可能成为CPF所致脑损伤的新的救治手段。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R595.4

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7 整理 郑颖t，

本文编号：1203090