胚胎期及出生早期脂多糖暴露对小鼠骨骼发育和成年期骨稳态的影响

发布时间：2017-12-05 10:24

  本文关键词：胚胎期及出生早期脂多糖暴露对小鼠骨骼发育和成年期骨稳态的影响

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【摘要】：骨骼系统是由骨组织和骨髓共同构成。近年来不断有研究发现,骨骼除了具有运动、保护内脏器官、支撑人体、参与调节钙磷代谢等基本功能外,还是一个多功能器官,参与多种生理、病理过程并发挥重要作用。在骨髓微环境中,造血干细胞生成各种血液细胞,成骨细胞与破骨细胞影响造血干细胞的生成和动员,此外,骨骼还能够像内分泌器官一样产生多种激素、生长因子及细胞因子,由此可见骨骼系统的重要性,骨骼通过与其他器官、系统协同作用,维持人体正常的生理活动。骨骼上述重要功能的发挥依赖于骨骼稳态的维持。成骨细胞介导的骨形成及破骨细胞介导的骨吸收相互耦联调节骨稳态平衡。当骨形成减少或骨吸收增加均可导致骨质疏松发生。骨质疏松(osteoporosis)是一种以骨强度降低为主要表现的慢性代谢性骨骼疾病,随着我国人口老龄化的趋势,骨质疏松的发病率也逐年增加,现已成为严重影响我国老年人健康的高发病。骨质疏松可导致骨折风险增加,其中最严重的并发症---髋部骨折,其致死、致残率高。然而骨质疏松的发生机制尚未完全阐明,吸烟、饮酒、绝经、遗传等因素都与其发病相关。健康和疾病的发育起源(The developmental origins of health and disease,DOHa D)假说认为人类在发育过程的早期(包括胎儿、婴儿、幼儿时期)接受的多种不利因素(如药物、酒精、营养不良、缺氧、炎症等)可影响包括骨质疏松、糖脂代谢、哮喘、肿瘤、心血管系统疾病、精神神经系统疾病等在内的多种成年期慢性非传染性疾病(non-communicable diseases,NCDs)的发生、发展。但生命早期(孕期和产后早期)不利因素的刺激对骨骼发育及其成年期骨稳态的具体作用及其可能的机制尚不清楚。明确这点有助于揭示骨质疏松新的发病机制,并从更广泛的意义阐明生命早期不利因素刺激与成年期慢性非传染性疾病的发育起源的关系。炎症因素是临床上个体发育过程的早期接受的常见不利因素之一,如孕期的牙龈感染、上呼吸道感染、宫内感染等。此外,婴幼儿时期的个体免疫系统尚未发育成熟,抵抗力差,炎性疾病的发病率较高。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏染色阴性细菌外膜的主要成分,存在于多种病原菌中,可导致炎症的发生。因此本研究以LPS为致炎因子处理骨组织或动物模型,观察胚胎期及出生早期炎症因素刺激对骨骼发育及成年期骨稳态的影响。目的:利用胚胎期及出生后早期LPS刺激模型,检测生长板长度、体格参数、骨量、破骨细胞活性、成骨细胞及破骨细胞相关基因m RNA表达情况等指标以明确生命早期炎症因素对骨骼发育及骨稳态的影响。方法:第一部分:1.分离E18.5 d小鼠跖骨和胫骨,分为对照组及LPS组,LPS组以10μg/m L LPS(0111:B4)处理7d。2.第1、7天测量跖骨和胫骨全长及矿化带长度,计算跖骨和胫骨全长增长率(TL-rate)、矿化带增长率(CZ-rate)、第7天矿化带占骨全长的比例(CZ%)。3.培养7d后标本取材,臧红固绿、甲苯胺蓝染色观察肥大带宽度;Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型胶原(collagenⅩ,ColⅩ)免疫组化染色观察软骨细胞分化;TUNEL染色观察软骨细胞凋亡。4.C57小鼠分为LPS组和对照组,于E15.5腹腔注射LPS(0111:B4)25ug/kg,或等剂量生理盐水,子代小鼠2m、4m及8m取材。5.小鼠宏观表型观察:体重、尾长。6.整体X光、离体股骨X光、离体股骨Micro-CT扫描检测小鼠骨量变化。7.臧红固绿染色测量生长板厚度、HE染色观察骨小梁、TRAP染色观察破骨细胞活性。8.定量PCR检测股骨组织成骨相关基因(OP、OC)及破骨相关基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)的表达。第二部分:1.出生后5d的C57小鼠分为LPS组和对照组,LPS组腹腔注射LPS(0111:B4)2mg/kg,对照组腹腔注射等剂量生理盐水,2m、4m及8m取材。2.同第一部分5~8。结果:第一部分:1.与对照组比较,LPS处理后跖骨和胫骨TL-rate及CZ-rate明显降低(跖骨TL-rate P=0.025);(跖骨CZ-rate P=0.019);(胫骨TL-rate P=0.010);(胫骨CZ-rate P=0.024)。LPS组胫骨肥大带较对照组明显变短(P0.001)。与对照组比较,LPS组胫骨的软骨分化相关蛋白CoⅡ、ColⅩ表达降低,软骨细胞凋亡明显增加。2.胚胎期LPS暴露小鼠身出生后身长变短、体重下降(P0.05)。3.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期骨密度较对照小鼠降低。Micro-CT发现与同龄对照组小鼠比较,LPS组小鼠骨小梁BV/TV下降(P0.05)、Tb.N减少(P0.05)、Tb.Th减少(P0.05)、Tb.Sp增高(P0.05)、SMI增高(P0.05),骨皮质BV/TV下降(P0.05)、C.Th减少(P0.05)。4.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期生长板窄于同龄对照组小鼠(P0.05),且其骨小梁稀疏,反映破骨细胞功能的指标Oc.S/BS、N.Oc/t.Ar、N.Oc/B.Pm高于对照组(P0.05)。。5.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期成骨(OP、OC)相关基因表达降低(P0.05)、破骨相关基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)表达增高(P0.05)。第二部分:1.出生早期LPS刺激的小鼠身长、体重均明显低于对照组(P0.05)。2.出生早期LPS刺激的小鼠2m、4m、8m时间点骨密度降低,Micro-CT结果示LPS组骨小梁BV/TV下降(P0.05)、Tb.N减少(P0.05)、Tb.Th减少(P0.05)、Tb.Sp增高(P0.05)、SMI增高(P0.05),同时,骨皮质BV/TV下降(P0.05)、C.Th减少(P0.05)。3.出生早期LPS刺激的小鼠在成年期生长板窄于对照组(P0.05)、骨小梁比对照组稀疏,破骨细胞Oc.S/BS、N.Oc/t.Ar、N.Oc/B.Pm高于对照组(P0.05)。4.出生早期LPS刺激的小鼠在成年期2m、4m、8m时间点的成骨相关基因(OP、OC)(P0.05)表达降低、破骨相关基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)表达增高(P0.05)。结论:第一部分:LPS通过抑制软骨增生、分化及促进肥大带软骨细胞凋亡来抑制胚胎期小鼠骨骼发育。胚胎期LPS刺激导致小鼠成年期骨量降低,可能与成骨细胞分化相关基因表达下降、破骨细胞吸收相关基因表达增加,破骨数量增加、骨吸收活性增强有关。第二部分:出生早期一过性LPS刺激可抑制小鼠骨骼发育,且其成年期出现骨量降低,可能与骨形成抑制及骨吸收增强有关。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580

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本文编号：1254484