人GJB6基因突变对HaCaT细胞增殖与凋亡的影响和机制

发布时间：2017-12-06 15:24

  本文关键词：人GJB6基因突变对HaCaT细胞增殖与凋亡的影响和机制

  更多相关文章： 有汗性外胚叶发育不良 缝隙连接蛋白 Tet-on HaCaT细胞 凋亡

【摘要】：目的有汗性外胚叶发育不良(hidrotic ectodermal dysplasia, HED)是一种常染色体显性外胚叶发育不良疾病。当编码Cx30缝隙连接蛋白的GJB6基因发生突变时,可引起耳聋和有汗性外胚叶发育不良。本研究中,以Tet-on慢病毒为载体建立稳定表达GJB6基因及其突变体的HaCaT细胞株,进一步了解GJB6基因突变引起HaCaT细胞凋亡的机制,初步探究GJB6基因突变体引起HED不同临床表型的可能机制。方法利用PCR技术扩增人GJB6基因野生型与突变型(A88V、G11R)基因,重组Tet-on'慢病毒质粒,经基因测序及酶切技术对其鉴定,再将重组慢病毒转染入HaCaT细胞,经puromycin筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白Cx30的GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素(DOX)诱导后,通过RT-PCR检测GJB6基因的mRNA表达量,同时通过Western blot检测Cx30的表达,从而对稳定表达GJB6基因的HaCaT细胞株进行鉴定。用CCK8法检测GJB6基因野生型与突变型经DOX诱导表达后对细胞增殖的影响。利用流式细胞分析法检测加DOX诱导基因表达后对HaCaT细胞凋亡的影响。通过Western blot检测HED相关临床表型指标和相关凋亡指标的蛋白水平的变化。结果经酶切、测序鉴定重组慢病毒质粒构建成功。RT-PCR检测到稳定转染的HaCaT细胞中GJB6基因的mRNA表达量明显增加,WT(加四环素)组GJB6基因表达丰度是WT(不加四环素)组的113.369倍(P0.05)； A88V(加四环素)组GJB6基因表达丰度是A88V(不加四环素)组的3.249倍(P0.05)；G11R(加四环素)组GJB6基因表达丰度是G11R(不加四环素)组的32.011倍(P0.05)；Western blot可检测到经DOX处理的WT组和A88V组、G11R组稳定表达Cx30,而未经DOX处理的细胞和NC组细胞未检测到Cx30目的条带。NC组：加入四环素与不加入四环素在各个时间节点(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值无统计学差异；WT组：加入四环素与不加入四环素在以下时间节点(4、8、12、24、36 h)吸光度值存在统计学差异；A88V组：加入四环素与不加入四环素在各个时间节点(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值均存在统计学差异；G11R组：加入四环素与不加入四环素在各个时间节点(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值均存在统计学差异。流式细胞分析法检测到相比NC组、WT组,A88V、G11R组明显降低了细胞的增值率,导致HaCaT细胞的凋亡,经统计分析,P0.05。加入四环素诱导后,GJB6基因突变型A88V.G11R可引起内披蛋白表达量降低,丝聚蛋白、角蛋白K6b、兜甲蛋白表达量无明显变化。凋亡指标Bcl-2、Bax的表达量无明显改变；Caspase 3、Caspase8、Caspase9、 PARP等凋亡相关指标可见其剪切体。结论成功构建出稳定表达GJB6基因野生型及其突变体A88V.G11R的HaCaT细胞株,进一步探究了突变型A88V、G11R导致HaCaT细胞凋亡的可能机制,初步了解GJB6基因突变体引起HED不同临床表型的可能机制,为下一步研究其发病机制奠定了基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R596.1

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