小型猪胰岛细胞异种移植治疗Ⅰ型糖尿病的实验研究

发布时间：2016-10-22 13:41

  本文关键词：西藏小型猪糖尿病模型的建立及胰岛细胞分离纯化的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《南方医科大学》 2012年

小型猪胰岛细胞异种移植治疗Ⅰ型糖尿病的实验研究

唐华  

【摘要】：研究背景 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是严重影响人类健康和生命的高发病。糖尿病又分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型糖尿病为胰岛素依赖型,大约5-10%的糖尿病患者为Ⅰ型糖尿病。Ⅱ型糖尿病为非胰岛素依赖型,占糖尿病患者的90%以上。超过三分之一的Ⅱ型糖尿病患者至中、晚期时也会发展成为胰岛素依赖型。目前全球有糖尿病患者3.66亿,较2010年的2.85亿增加近30%。每年有460万人死于糖尿病,用于糖尿病的医疗费用高达4650亿美元。注射胰岛素是目前能有效控制糖尿病患者血糖的手段。但是外源性胰岛素不能达到生理性调节血糖的目的,因此不能防止或延缓糖尿病并发症的发生,如肾病、神经系统疾病、视网膜病变以及心血管病等,从而大大降低了患者的生活质量,甚至危及生命。美国现在每年用于糖尿病的医疗保健费用已占其整个国民保健费用的八分之一。我国每年用于该方面的医疗保健费用亦高达2500亿元人民币之多,并且费用还在逐年增高。因此开发和应用根治糖尿病的有效方法或手段无疑具有重大的社会意义和经济效益。 研究目的和意义 胰岛移植被认为是攻克Ⅰ型糖尿病的有力治疗手段,但胰岛细胞供体的缺乏与移植后的免疫排斥反应仍是胰岛移植不可回避的两大难题。异种移植技术的出现,为糖尿病的治疗提供了新的思路,它将从根本上解决供体细胞缺乏的难题,将创造不可估量的社会价值。由于猪胰岛素具有与人胰岛素相似的生理功能,而且在结构上几乎完全一致,只有一个氨基酸的差别(链上的最后一个氨基酸残基-人为苏氨酸,猪为丙氨酸),最大程度上降低了免疫排斥反应,而且猪胰岛细胞的血糖调定点与人极其相似,因此,猪胰岛作为异种胰岛组织供体来源日益受到重视。但是由于猪胰岛的分离比其他动物困难,至今未能确立能够稳定地获得大量猪胰岛细胞的分离方法。 当然,异种移植技术的应用必然也伴随着新的问题与挑战。本研究以建立一种经门静脉肝内异种移植胰岛细胞治疗SD大鼠Ⅰ型糖尿病的动物模型为目的,以异种移植技术的发展和目前的应用状况为研究背景,我们从小型猪胰岛细胞的分离纯化、Ⅰ型糖尿病动物模型的建立和胰岛细胞异种移植三方面入手,进一步研究Ⅰ型糖尿病的发病机制和治疗方法,为临床异种胰岛细胞移植和先期临床开展供体处理提供可靠的资料和经验。 研究方法和结果 本文研究的主要内容分为三个部分：(1)SD大鼠Ⅰ型糖尿病动物模型的建立；(2)西藏小型猪胰岛细胞分离纯化及功能测定；(3)西藏小型猪胰岛细胞异种移植治疗Ⅰ型糖尿病SD大鼠的实验研究。 第一章SD大鼠Ⅰ型糖尿病动物模型的建立 选择180-220g的雄性健康SD大鼠80只,随机分组后,对照组和实验组各为40只。动物饲养在清洁级环境中,18-22℃室温,室内氨浓度20ppm,相对湿度为40%-70%。标准配合饲料饲养,每笼5只,自由采食和饮水,勤换垫料,保持饲养环境通风和干燥。 SD大鼠经适应性饲养1周后进行造模,造模前测定空腹血糖,禁食12h,按体重给予65mg/kg的STZ(以1.1mol/L, PH4.0的柠檬酸缓冲液溶解,临时配制成4mg/ml浓度)腹腔一次性注射,对照组注射柠檬酸缓冲液。7天后尾静脉采血测外周血血糖。若注射前血糖水平8.9mmol/1,注射后血糖维持在16.7mmol/L以上达两周的,即可认为造模成功。在造模过程中,测定造模前和造模后1周、2周、4周和6周时的体重,并根据测定的结果绘制两组大鼠的生长曲线。HE染色做胰腺病理观察。 结果显示,链脲佐菌素能很好的诱导大鼠发生Ⅰ型糖尿病,造模成功后实验组大鼠的血糖明显高于对照组,并一直维持在较高水平,成模率为90%。造模成功后的大鼠表现为多食、多饮、多尿、体重减轻、活动减少、反应迟钝,伤口易感染、消瘦、被毛杂乱无光泽、脱毛等症状。 实验组大鼠在注射STZ溶液后,前期呈缓慢生长趋势,随着血糖的升高,体重逐渐呈现下降趋势,而对照组的大鼠体重持续增长,随着时间的延长,对照组和实验组大鼠的体重差异越来越大。病理观察发现糖尿病大鼠的胰岛明显萎缩。 第二章西藏小型猪胰岛细胞分离纯化及功能测定 选择6月龄雄性西藏小型猪,体健无传染性疾病,体重20-25kg,术前禁食12h,可自由饮水。速眠新(0.1mL/kg)肌内注射诱导麻醉后,待动物反应迟钝、不能站立、痛觉反射不明显后,上多功能动物麻醉机,用异氟烷进行麻醉维持。在相对无菌条件下取出胰腺,热缺血时间不超过10分钟,冷缺血时间不超过45分钟。1g/L的V型胶原酶溶液经胰导管逆行灌注,38.5℃水浴箱静止消化大约30min,待大量胰岛脱离下来时,用含10%胎牛血清的hanks液终止消化。600μm细胞筛过滤收集消化产物。未消化完全的胰腺重复消化一次再过滤收集,然后用Ficoll400密度梯度离心法离心纯化胰岛细胞,使用1.090g/cm3、1.074g/cm3、1.054g/cm3三种密度,4℃,1000r/min及2000r/min,分别离心2min和10min,在1.054-1.074之间收集胰岛细胞。 纯度与活性：双硫腙染色,倒置显微镜下观察记数胰岛的产量及纯度的计算,胰岛素释放实验检测胰岛细胞的功能。 结果表明,此方法可以获得结构完整、纯度较高、并保持良好活性的胰岛细胞,经胶原酶V消化后的胰岛,在倒置显微镜下可见胰岛呈圆形、椭圆形或不规则形,大小不一,大部分胰岛包膜完整,折光性好,大量胰腺外分泌腺泡细胞和组织碎片包绕着散在分布的胰岛细胞团,直径多在50-200μm之间。纯化后平均每克小型猪的胰腺组织可以获得(2807±124)IEQ(胰岛细胞当量),平均纯度为(81.1±1.3)%。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖加茶碱组的胰岛素释放量为低糖组的3.60倍(P0.01),高糖组是低糖组的1.67倍(P0.01)。表明纯化后的胰岛具有较好的生物学功能。 第三章西藏小型猪胰岛细胞异种移植治疗Ⅰ型糖尿病的实验研究 移植前24h测定糖尿病SD大鼠的血糖。用3%的戊巴比妥钠按1.0ml/kg的剂量通过腹腔注射将糖尿病SD大鼠麻醉后,仰卧固定在大鼠保定板上,去除手术部位的被毛,碘伏消毒后铺手术巾。在上腹部正中切一长约3cm的切口,进入腹腔后暴露门静脉主干,先用血管缝合线于门静脉主干做一荷包暂不收缩打结,再将装有胰岛细胞悬液的注射器接上头皮静脉留置针,于荷包中心处穿刺后退出针芯,收紧血管缝合线以免出血,将小型猪胰岛细胞悬液缓慢注入门静脉内收紧血管缝合线并打结。 本研究设定了10000IEQ/kg、20000IEQ/kg、30000IEQ/kg和40000IEQ/kg四种移植量。确定最佳移植量后,在此移植量的基础上,使用KF506、CSA两种免疫抑制剂,分单用和联合应用共三种方法,探讨这三种免疫抑制方案的抗排斥效果。 结果表明,西藏小型猪胰岛异种移植治疗SD大鼠糖尿病时,能够有效地降低大鼠的血糖,在使用10000IEQ/kg、20000IEQ/kg、30000IEQ/kg和40000IEQ/kg四种不同移植量时,以20000IEQ/kg、30000IEQ/kg和40000IEQ/kg移植量的降血糖效果明显,但是三者之间,随着移植量的增大,降血糖的效果并没有统计学意义,因此我们最终确定20000IEQ/kg为最佳移植剂量。 在使用三种不同的免疫抑制方案时,CSA和KF506在异种移植猪胰岛治疗大鼠1型糖尿病时有较好的抗免疫排斥作用,二者联合应用时表现出明显的协同作用,能有效地延长移植物的存活时间。 结论 1、STZ可以稳定地诱导出大鼠糖尿病模型,具有成模率高、死亡率低、等特点,糖尿病模型大鼠能长时间维持高血糖。 2、使用胶原酶V经胰管逆行灌注消化的方法可以稳定地获得结构完整、生物学功能良好的小型猪胰岛细胞。 3、小型猪胰岛异种移植治疗大鼠1型糖尿病时,能有效地降低糖尿病大鼠的血糖,使用免疫抑制剂,可得到良好的抗排斥反应效果,能有效延长移植物的存活时间。

【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R587.1
【目录】：

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