miR-141对老年雌性恒河猴骨质疏松的治疗作用研究

发布时间：2018-02-15 09:35

本文关键词： miR-141 破骨细胞 CALCR 骨质疏松恒河猴　出处：《华南农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：骨质疏松症是一种全球性的疾病。虽然治疗骨质疏松症的药物多种多样,但是仍然存在许多缺陷。因此,研发治疗骨质疏松的新药物成为一个亟待解决的科学问题。本文旨在探索miR-141在恒河猴骨质疏松中的治疗作用及其作用机制,从而为治疗骨质疏松症开辟新的研究方向。首先,我们收集了23例69岁以上老年女性的骨骼样本,对这些骨骼样品中miR-141的水平和骨密度进行了检测。同时,我们还收集了32只12岁以上的恒河猴骨骼样本,检测其miR-141水平和骨密度。我们还构建了3只卵巢摘除所致的恒河猴骨质疏松模型,检测了该模型中的miR-141的水平变化。进一步选择了12只18岁以上的老年雌性恒河猴作为绝经期后骨质疏松案例,检测了这些恒河猴的体重、腰椎与髋骨的骨密度和血清中NTx(I型胶原交联N端肽)、CTx(I型胶原交联C端肽)、TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)的含量。随后,随机将12只恒河猴分成2组,每周通过静脉给予实验组或对照组20 mg/kg的miR-NC(对照组)或miR-141模拟物(实验组)。每两周对恒河猴的行为和体重进行记录,同时对其骨密度进行CT检测,并抽取3mL外周血进行血清中的骨吸收指标NTx、CTx和TRAP5b含量进行检测。12周给药之后对分别对对照组和实验组恒河猴进行安乐死,取其心、肝、脾、肾、腰椎、髋骨和下肢骨。对其心、肝、脾、肾进行HE染色观察其病理学变化;对胫骨进行microCT检测其骨密度变化;对腰椎和髋骨进行HE、TRAP染色检测骨小梁和破骨细胞的变化。另外,我们抽取雌性恒河猴骨髓,分离骨髓单核巨噬细胞,利用M-CSF(50ng/mL)和RANKL(100ng/mL)诱导破骨细胞体外分化。在分化过程中转染miR-NC、miR-141或其抑制剂(Anti-miR-NC和Anti-miR-141),利用Q-PCR技术检测破骨细胞分化的特异基因TNFRSF11A、TRAP、CTSK的表达水平。同时,对体外培养的细胞进行TRAP染色。我们还通过软件预测了miR-141的靶基因,并将该基因的3’UTR区域克隆到双荧光报告载体中。将克隆有靶基因3’UTR的双荧光报告载体与miR-NC、miR-141和miR-141突变体(miR-141-MUT1和miR-141-MUT2)共转染到恒河猴破骨细胞中,检测荧光素酶活性的变化。同时用Q-PCR技术检测CALCR的m RNA水平的变化,用Western blot技术检测在此过程中靶基因的蛋白含量的变化。最后检测了miR-NC组和miR-141组恒河猴骨骼中miR-141靶基因蛋白的含量变化。实验结果表明,人和恒河猴骨骼样本中miR-141的水平和骨密度成正相关关系,并且在卵巢摘除骨质疏松动物模型中miR-141的水平也明显下降。将miR-141给予老年雌性恒河猴12周,其胫骨、髋骨和腰椎的骨密度明显增加,进一步对腰椎和髋骨的HE染色同样发现其骨小梁的数量,厚度,骨体积都有明显增加。在实验过程中实验组和对照组的恒河猴并没有表现出明显的行为差异,也没有表现出明显的体重变化。对实验组恒河猴的主要器官组织进行HE染色未见明显病理变化。相对对照组,实验组恒河猴的髋骨和腰椎的破骨细胞的数量、破骨细胞所占面积都有明显增加。对恒河猴的破骨细胞进行体外诱导过表达或抑制miR-141后,发现破骨细胞分化的特异基因表达水平明显下降或升高,并且通过TRAP染色,进一步揭示多核破骨细胞的数量明显下降或上升。最后我们预测了miR-141的靶基因,发现miR-141靶向CALCR的3’UTR区域。通过双荧光报告系统检测,我们发现miR-141能够抑制克隆有CALCR3’UTR的双荧光报告载体的荧光素酶活性。同时Q-PCR检测结果表明miR-141的抑制剂不能够引起明显的CALCR的mRNA水平变化,但是miR-141可以明显的抑制CALCR蛋白的表达量。研究结果表明给予miR-141能够有效地缓解老年雌性恒猴的骨量丢失,从而为治疗骨质疏提供了一个新治疗方向。
[Abstract]:In order to explore the therapeutic effect and mechanism of miR - 141 in the osteoporosis of rhesus monkeys , the changes of miR - 141 levels and bone density were detected by HE and TRAP staining . The results showed that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR protein . At the same time , we found that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR . At the same time , we found that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR protein .

【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580

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