胰高血糖素通过DAG-PKC信号通路对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响

发布时间：2018-03-02 03:35

  本文关键词： 胰高血糖素 胰岛素分泌 2型糖尿病 DAG-PKC信号通路　出处：《石河子大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:通过探讨不同浓度的胰高血糖素(Glucagon,GC)及不同浓度葡萄糖(Glucose,Glu)刺激对胰岛β细胞系MIN6细胞中胰岛素(insulin,Ins)分泌的影响及对二脂酰甘油(Diacylglycerol,DAG)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表达的影响,进一步明确GC对胰岛素分泌的作用及机制。方法:1.对小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞进行体外培养,生长到一定细胞密度之后进行传代及分组,在不同Glu浓度即无糖(0mmol/L)、低糖(2.8mmol/L)及高糖(16.7mmol/L)和不同GC浓度即无GC(0ng/L)、低浓度GC(100ng/L)、中浓度GC(500ng/L)及高浓度GC(1000ng/L)的刺激作用下收集细胞培养皿中的上清液,采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测DAG浓度的水平;2.将敏感的荧光生物传感器CKAR(PKC表达的质粒)及阴性对照空质粒PCDNA3.1采用真核细胞电穿孔的方法转染入MIN6细胞中,在不同Glu及不同GC浓度刺激因素下采用基于荧光生物传感器的荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的技术观察细胞荧光的变化从而实时测定细胞内PKC含量的表达;3.采用ELISA法检测细胞内胰岛素分泌的水平。结果:1.ELISA法检测不同浓度Glu及不同浓度GC刺激下MIN6细胞上清液中DAG含量的结果如下:(1)在低糖和高糖浓度条件下,随着GC浓度的升高,DAG含量也随之升高,趋势明显,且高糖浓度下,DAG增加趋势较低糖浓度下增加趋势更加明显;在无糖浓度条件下高浓度GC刺激下DAG浓度没有随GC浓度升高而升高的趋势。(2)不同GC浓度组间进行比较:无糖条件下,中GC组DAG水平高于无GC组(P0.05);低糖条件下:高、中、低GC组DAG水平均高于无GC组(P0.05),高GC高于低GC组(P0.001),高GC组DAG水平高于中GC组(P0.001);高糖环境下:高、中GC组DAG水平均高于无GC组(P0.001),高GC组DAG水平高于低GC组(P0.001),高GC组DAG水平高于中GC组(P0.05)。2.基于荧光生物传感器的FRET技术检测MIN6细胞内PKC含量的变化:转染空质粒:加入1000ng/LGC+16.7Glu处理组后与空白对照组kreb液相比CFP/YFP比值无明显差异P0.05;转染PKC质粒CKAR后:(1)无糖时,在低浓度GC及中浓度GC刺激下,CFP/YFP比值曲线上升,曲线上升趋势平缓,且中浓度GC刺激下较低浓度GC刺激下CPP/YFP比值差异明显(P0.05);高浓度GC刺激后,CFP/YFP曲线没有上升的趋势。(2)在低糖条件下,给予低浓度及中浓度GC处理CFP/YFP比值曲线上升,上升趋势平缓,且中浓度GC刺激较低浓度刺激时相比CFP/YFP比值差异明显(P0.05);给予高浓度GC刺激后,CFP/YFP曲线继续上升,上升趋势较明显,较低浓度GC及中浓度GC刺激阶段相比比值升高(P0.05)。(3)在高糖条件下,给予低浓度及中浓度GC处理CFP/YFP比值曲线上升,上升趋势平缓,给予高浓度GC刺激后,CFP/YFP曲线继续上升,上升趋势较明显,较低浓度GC及中浓度GC刺激阶段相比比值升高(P0.05)。3.ELISA法检测不用浓度GC及不同浓度Glu刺激下MIN6细胞上清液中胰岛素含量的结果如下:(1)在无糖,低糖,高糖浓度下,随着GC浓度的增加,MIN6细胞胰岛素分泌量也随之增加,且随着葡萄糖浓度由低到高,胰岛素分泌量增加趋势越明显,在高糖浓度下,胰岛素浓度增加趋势最大。(2)不同GC浓度组间进行比较:无糖条件下,高、中、低GC组胰岛素浓度均高于无GC组(P0.01),高GC组胰岛素浓度高于低中GC组(P0.01);低糖条件下,高GC和中GC组胰岛素浓度均高于无GC组(P0.01),高GC组高于低GC组(P0.01);高糖条件下,高GC和中GC组胰岛素浓度均高于无GC组(P0.05),高GC和中GC组均高于低GC组(P0.01),高GC组高于中GC组(P0.01);结论:1.GC可能以浓度梯度的形式通过增加第二信使信号通路DAG-PKC通路中DAG及PKC含量从而增加MIN6细胞中胰岛素的分泌。2.GC通过DAG-PKC通路增加胰岛素分泌的作用具有一定的葡萄糖依赖性。
[Abstract]:Objective: To explore the effect of different concentrations of glucagon (Glucagon, GC) and different concentrations of glucose (Glucose, Glu) stimulation on MIN6 cell insulin in islet beta cell lines (insulin, Ins) and the secretion of two acyl glycerol (Diacylglycerol, DAG), protein kinase C (protein kinase C. PKC) on the expression of GC, to further clarify the role and mechanism of insulin secretion. Methods: 1. of mouse insulinoma cell line MIN6 cells were cultured in vitro, growth to after a certain cell density were passaged and grouped in different Glu concentration is sugar free, low sugar (0mmol/L) (2.8mmol/L) and high glucose (16.7mmol/L) and the different concentration of GC is GC (0ng/L), low concentration of GC (100ng/L), GC (500ng/L) concentration and high concentration of GC (1000ng/L) culture supernatant in the dish collection of cell stimulation, using enzyme-linked immunosorbent method (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) detection of DAG 娴撳害鐨勬按骞，

本文编号：1554878