FBW7对高糖诱导肾系膜细胞自噬信号的调节作用研究

发布时间：2018-03-13 02:37

本文选题：糖尿病肾病　切入点：自噬　出处：《西南医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:20%~40%糖尿病患者可能会发生糖尿病肾病,最后发展为肾功能衰竭尿毒症。强化血糖控制可以延缓糖尿病肾病的发生,但高血糖状态下引起肾脏病变的机制尚未明确。目前研究表明自噬参与了糖尿病肾病发生发展,自噬可以降解衰老的细胞器、多余的蛋白、有害的细胞质成分,有研究表明糖尿病肾病的小鼠比正常小鼠自噬水平低。调节自噬信号最经典的负调控信号途径是P13K-Akt-mTOR,mTOR可作为FBW7的底物蛋白,能被泛素化修饰并被蛋白酶体降解,FBW7是SCF型(Skp1 Cullin1 F-box protein)E3泛素连接酶的识别亚基。糖尿病mTOR信号分子究竟如何表达,FBW7是否参与了对mTOR信号通路的调节进而参与了糖尿病肾病的发生?为此,我们体外培养肾系膜细胞,研究高糖对FBW7表达的影响及其对自噬信号的调控作用,为深入研究糖尿病肾病提供新的理论依据。方法:(1)不同浓度葡萄糖对肾系膜细胞FBW7、LC3-II/I、mTOR、p-mTOR、I型胶原蛋白(Col-I)、IL-1β、caspase-1表达以及自噬溶酶体的影响:将小鼠肾系膜细胞进行体外培养72h,分组如下(1)正常糖组(NC);(2)渗透压对照组(OP);(3)高糖干预组(10mmol/L葡萄糖,HG1组);(4)高糖干预组(20mmol/L葡萄糖,HG2组);(5)高糖干预组(30mmol/L葡萄糖,HG3组)。采用western blot检测FBW7、mTOR、p-mTOR的表达水平以及LC3-II/I比值,采用RT-PCR进一步检测FBW7的mRNA水平;采用激光共聚焦显微镜检测自噬溶酶体;采用ELISA检测Col-I、IL-1β、caspase-1表达。(2)不同时间高糖对肾系膜细胞lc3-ii/i、fbw7、mtor、p-mtor、自噬溶酶体、col-i、il-1β、caspase-1表达的影响:以5.6mmol/l葡萄糖为对照,用30mmol/l高糖分别对小鼠肾小球系膜细胞细胞干预2h、6h、12h、24h、48h、72h,并采用上述技术检测相关蛋白水平及自噬水平。(3)雷帕霉素干预对肾系膜细胞mtor、p-mtor、lc3-ii/i、col-i、il-1β、caspase-1、自噬溶酶体的影响:将小鼠肾小球系膜细胞体外培养72h,使用雷帕霉素抑制mtor。分组如下(1)nc组;(2)nc-rapa3组;(3)hg3组;(4)hg3-rapa3组。采用上述技术检测相关蛋白水平及自噬水平。(4)基因沉默fbw7对系膜细胞mtor、p-mtor、lc3-ii/i、自噬溶酶体、col-i、il-1β、caspase-1表达的影响:选择自噬最强的条件进行基因沉默fbw7,分组如下(1)nc组;(2)nc-sifbw7组;(3)hg3组;(4)hg3-sifbw7组。采用上述技术检测相关蛋白水平及自噬水平。(5)过表达fbw7对系膜细胞fbw7、lc3-ii/i、mtor、p-mtor、自噬溶酶体、col-i、il-1β、caspase-1表达的影响:选择自噬最弱的条件进行过表达fbw7实验,分组如下(1)nc-lv-con238组;(2)nc-lv-fbw7组;(3)hg3-lv-con238组;(4)hg3-lv-fbw7组。采用上述技术检测相关蛋白水平及自噬水平。结果:(1)以不同浓度的葡萄糖持续刺激小鼠肾小球系膜细胞72小时,发现葡萄糖浓度越高,fbw7、lc3-ii/i比值和自噬溶酶体表达水平越低,mtor、p-mtor、col-i、il-1β、caspase-1的表达水平越高(p0.05)。(2)30mmol/l高糖分别对小鼠肾系膜细胞刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h,发现12h组fbw7、lc3-ii/i比值和自噬溶酶体显著增加,mtor和p-mtor蛋白表达显著减少(p0.05)。72h组fbw7、lc3-ii/i比值和自噬溶酶体表达显著减少,mtor和p-mtor、col-i、il-1β、caspase-1表达显著增加(P0.05)。自噬活性最强的刺激条件30 mmol/L葡萄糖刺激12小时,自噬活性最弱的条件是30 mmol/L葡萄糖刺激72小时。(3)雷帕霉素干预高糖刺激的肾系膜细胞,mTOR、p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表达显著减少,LC3-II/I比值显著增加,自噬溶酶体数目显著增加(P0.05)。(4)基因沉默FBW7可使FBW7、LC3-II/I比值显著减少,mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表达显著增加,自噬溶酶体数目显著减少(P0.05)。(5)过表达FBW7实验可使FBW7、LC3-II/I比值显著增加,mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表达显著减少,自噬溶酶体数目显著增加(P0.05)。结论:1.短时间的高糖刺激可以上调FBW7表达,抑制mTOR,引起小鼠肾系膜细胞自噬活性增强,可能对早期糖尿病肾脏有保护作用。2.长时间高糖刺激可以下调FBW7表达激活mTOR,引起小鼠肾系膜细胞自噬水平的降低,可能参与肾脏炎症和纤维化的形成。3.FBW7可能通过调控肾系膜细胞自噬水平参与了糖尿病肾病的发生。
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【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】