CXC趋化因子受体4转染大鼠骨髓间充质干细胞治疗糖尿病大鼠视网膜病变的实验研究

发布时间：2018-03-16 16:23

  本文选题：CXC趋化因子受体4　切入点：间充质干细胞　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:应用经慢病毒转染后过表达CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)通过玻璃体腔注射移植到糖尿病大鼠体内后,观察过表达CXCR4的BMSCs是否具有更好的治疗作用,并探讨其治疗糖尿病大鼠视网膜病变可能的机制。方法:1.原代分离、培养BMSCs,并对其细胞免疫表型进行鉴定。2.利用基因重组方法构建慢病毒载体,将CXCR4目的基因转染至第3代BMSCs,并进行免疫荧光、Western-Blot、q-PCR检测目的基因转染后CXCR4基因在BMSCs中表达的情况;通过MTS细胞增殖实验检测BMSCs的增殖能力,观察转染CXCR4基因后BMSCs增殖能力是否有变化。通过transwell小室进行BMSCs的趋化实验检测,观察在SDF-1的诱导下转染CXCR4基因后BMSCs迁移能力是否增强。通过流式细胞仪对BMSCs凋亡程度检查,观察转染CXCR4基因后BMSCs凋亡程度是否有变化。3.将过表达CXCR4的第3代BMSCs移植到STZ诱导4w的糖尿病大鼠玻璃体腔体内,检测各组移植前及移植后1w、2w、3w大鼠血糖、体重等大体情况。实验动物分组:正常对照组(正常组)、糖尿病大鼠对照组(Blank组)、磷酸盐缓冲液治疗组(PBS组)、注射未经处理BMSCs治疗组(native组)、注射GFP病毒感染BMSCs治疗组(GFP组)、注射CXCR4-GFP病毒感染BMSCs治疗组(CXCR4组)。造模成功后进行干预治疗,其中PBS组、native组、GFP组、CXCR4组分别给予PBS、BMSCs、GFP-BMSCs、CXCR4-GFP-BMSCs玻璃体腔注射治疗,正常对照组和Blank组不予特殊治疗。注射后1w、2w、3w观察各组视网膜石蜡切片HE染色病理组织学变化,western-blotting和免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜组织中Rhodopsin、NSE及炎症因子IL-6、TNF-α蛋白表达变化,统计对比后得出结论。结果:1.从大鼠骨髓中易分离培养出BMSCs,细胞纯度高、形态均一且具有典型MSC形态特征,表达MSC特异抗原标志,体外扩增能力强且能保持其低分化状态和多向分化潜能;2.通过慢病毒转染后,可过表达CXCR4基因。同时在MTS增殖能力检测试验中发现,过表达CXCR4的BMSCs较正常的BMSCs和未转染目的基因的GFP-BMSCs细胞增殖能力没有明显差异(p0.05)。在transwell趋化实验中,在SDF-1诱导下过表达CXCR4的BMSCs较正常的BMSCs和未转染目的基因的GFP-BMSCs细胞迁移能力有明显提高(p0.05)。通过流式细胞仪对细胞凋亡程度的检查,发现过表达CXCR4的BMSCs较正常的BMSCs和未转染目的基因的GFP-BMSCs细胞凋亡程度没有明显差异(p0.05)。3.和对照组相比,玻璃体腔移植CXCR4-BMSCs后视网膜炎症程度明显减轻;并且视网膜组织中Rhodopsin、NSE蛋白表达明显升高,炎症因子IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低(P0.05)。结论:1、本研究在国内外首次采用过表达CXCR4基因的BMSCs治疗糖尿病大鼠模型,发现通过慢病毒转染过表达CXCR4的BMSCs其趋化、归巢能力明显增强,从而达到最大化的发挥外源性MSCs的治疗作用。2、过表达CXCR4的BMSCs较普通BMSCs能更好的减轻糖尿病大鼠视网膜病变炎症反应,而且推断其可以诱导视网膜出现相关蛋白的表达,从而更好的发挥对视网膜损伤的修复作用。
[Abstract]:Purpose: To study the expression of CXCR4 after lentivirus transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by intravitreal injection of transplanted into diabetic rats, observed the therapeutic effect whether the expression of CXCR4 BMSCs is better, and to explore the possible treatment of diabetic retinopathy in rats. Methods: the mechanism 1. primary cultured BMSCs, separation, and the immunophenotype of.2. by using the method of identification of recombinant lentiviral vectors of CXCR4 gene transfection to the third generation of BMSCs, and immunofluorescence, Western-Blot, expression of CXCR4 gene in BMSCs transfected with q-PCR gene detection purposes after the experiment; the proliferation of MTS cells to detect the proliferation of BMSCs, observed after CXCR4 gene transfection BMSCs proliferation ability is changing. Chemotaxis assays were performed for detection of BMSCs by Transwell assay, observed in SDF-1 induced with CXCR4 gene After the migration ability of BMSCs is enhanced. Through the examination of the BMSCs degree of apoptosis by flow cytometry, observe the transfection of CXCR4 gene after BMSCs apoptosis whether there are changes in.3. over expressed CXCR4 third glass cavity generation BMSCs transplanted to STZ 4W induced diabetic rats were detected before and after transplantation, graft 1W, 2W. 3W rats blood glucose, body weight and general situation. Animal groups: normal control group (normal group), diabetic rats control group (group Blank), phosphate buffer treatment group (PBS group), untreated BMSCs injection treatment group (native group), injection of GFP virus infection in BMSCs treatment group (GFP group injection of CXCR4-GFP virus infection), BMSCs treatment group (group CXCR4) were treated. After the modeling, PBS group, native group, GFP group, CXCR4 group were given PBS, BMSCs, GFP-BMSCs, CXCR4-GFP-BMSCs intravitreal injection, normal control group and Blank group were not special The treatment. After injection of 1W, 2W, 3W were observed in retinal paraffin section HE staining histopathological changes, Rhodopsin were detected in rat retinal tissue Western-blotting and immunohistochemistry, NSE and inflammatory factor IL-6, expression of TNF- protein, statistical comparison of the results. Results: 1. from rat bone marrow in isolated BMSCs cells, high purity, uniform shape and has the typical characteristic of MSC, the expression of markers of MSC specific antigen, in vitro amplification ability and can maintain its low state of differentiation and differentiation; 2. by lentivirus transfection, expression of CXCR4 gene can be found in the MTS. At the same time the proliferation test, the expression of CXCR4 BMSCs compared to the normal BMSCs and there was no significant difference between the proliferative capacity of GFP-BMSCs cells without transfection of target gene (P0.05). In Transwell chemotaxis, induced by SDF-1 overexpression of CXCR4 is BMSCs Often BMSCs and GFP-BMSCs gene transfected cell migration ability has improved significantly (P0.05). The degree of apoptosis by flow cytometry examination found that overexpression of GFP-BMSCs apoptosis CXCR4 BMSCs compared to the normal BMSCs and untransfected gene were not significantly different compared to.3. (P0.05) and the control group vitreous inflammation, retinal transplantation significantly reduced after CXCR4-BMSCs; and Rhodopsin in retinal tissue, expression of NSE protein in IL-6, inflammatory cytokines, expression of TNF- protein decreased significantly (P0.05). Conclusion: 1. For the first time in this paper using BMSCs treatment of diabetic rats and expression of CXCR4 gene, discovered by slow transfection over expression of CXCR4 BMSCs and its chemotaxis and homing ability was enhanced, so as to maximize the therapeutic effects of exogenous MSCs.2, overexpression of CXCR4 BMSCs compared with ordinary BMSCs It can better reduce the inflammatory reaction of diabetic retinopathy, and infer that it can induce the expression of related proteins in retina, so as to better play the role of retinal damage repair.

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R774.1

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 唐尧;糖尿病──21世纪困扰发展中国家的流行病[J];铁道医学;1995年05期

2 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1998年10期

3 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1998年01期

4 仝小林;;糖尿病9问(上)[J];药物与人;2007年03期

5 王秋月,刘国良;生活习惯与糖尿病[J];医师进修杂志;2000年09期

6 陈广耀;抗糖尿病中药开发前景展望[J];中国新药杂志;2000年07期

7 太田康晴,庄祥云;糖尿病[J];日本医学介绍;2000年08期

8 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年06期

9 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年08期

10 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年11期

相关会议论文 前10条

1 吴东方;庄跃宏;陈秀芳;赵丽娜;杨晓东;唐茂林;;胰岛素依赖型糖尿病对大鼠随意皮瓣存活能力的影响[A];中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编[C];2012年

2 崔瑾;韩姣姣;李凤翱;李凤翱;汤绍芳;刘萍;邱明才;张鹏;;1,25-二羟维生素D3对糖尿病大鼠肺脏病变的保护作用[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

3 郑滨珠;袁凤山;杨润桥;;自体干细胞激活疗法治疗糖尿病大鼠过程中血细胞及生化改变[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

4 刘铜华;吕仁和;高彦彬;;中医药防治糖尿病及并发症的作用途径[A];糖尿病（消渴病）中医诊治荟萃——全国第五次中医糖尿病学术大会论文集[C];1999年

5 石凤英;王尧;;灵芝对糖尿病大鼠肾脏形态学及微量白蛋白尿的作用[A];中国康复医学会第三次康复治疗学术大会论文汇编[C];2002年

6 陈名道;李荣英;邵莉;;糖尿病饮食治疗的若干进展[A];中国营养学会第九次全国营养学术会议论文摘要汇编[C];2004年

7 仝小林;李洪皎;;糖络并重治疗2型糖尿病[A];第九次全国中医糖尿病学术大会论文汇编[C];2006年

8 李筱荣;李艳;刘巨平;袁佳琴;;糖尿病大鼠血—视网膜屏障损伤的实验研究[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

9 杨毅;陈江华;王晶晶;秦岭;;雷帕霉素对糖尿病大鼠肾脏组织增殖和肥大的抑制作用[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年

10 祁少海;刘坡;舒斌;谢举临;徐盈斌;黄勇;毛任翔;刘旭盛;;不同深度糖尿病大鼠烫伤模型的制备[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

相关重要报纸文章 前10条

1 郭赛珊　梁晓春 潘明政;中西医结合治疗糖尿病慢性并发症可显著改善症状[N];中国中医药报;2007年

2 本报记者 王乐羊;中西医结合防治糖尿病大有可为[N];中国中医药报;2002年

3 北京协和医院 梁晓春;对中医治糖尿病并发症研究的思考[N];中国中医药报;2011年

4 刘燕玲;肥胖是糖尿病的源头[N];健康报;2006年

5 仝小林;糖尿病慢性并发症论治[N];中国中医药报;2003年

6 汪敏;糖尿病皮肤易损元凶找到[N];卫生与生活报;2003年

7 林兰;中西医结合治疗糖尿病的前景[N];中国中医药报;2007年

8 北京协和医院中医科主任 梁晓春;糖尿病周围神经病变的中西医治疗进展[N];中国医药报;2009年

9 本报记者 刘艳芳;糖尿病干预不能忽视抗氧化[N];中国食品报;2012年

10 谭小月;糖尿病与肾病关系研究的新进展[N];中国中医药报;2004年

相关博士学位论文 前10条

1 王健;CXC趋化因子受体4转染大鼠骨髓间充质干细胞治疗糖尿病大鼠视网膜病变的实验研究[D];天津医科大学;2017年

2 朱明;糖尿病中补体活化对间充质干细胞存活的影响及机制研究[D];第三军医大学;2017年

3 冯伟伟;苹果酸铬对2型糖尿病大鼠的降血糖活性、作用机制及安全性初探[D];江苏大学;2015年

4 刘宇;糖尿病来源的骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的相关研究[D];第四军医大学;2015年

5 李维辛;GLP-1受体激动剂治疗糖尿病的循证评价和对糖尿病大鼠胃动力影响的机制研究[D];兰州大学;2012年

6 田丽;糖尿病周围神经病运动纤维的早期评价[D];天津医科大学;2014年

7 柳忠豪;糖尿病对口腔种植体骨整合影响的作用机制研究[D];山东大学;2015年

8 李波;饱和富氢液对糖尿病神经病变的保护作用及机制研究[D];天津医科大学;2015年

9 米佳;Vaspin调控糖尿病炎症通路及苦酸通调法的干预机制研究[D];长春中医药大学;2015年

10 林宣佑;从SCAP/SREBP脂代谢信号转导途径探讨苦酸通调方调控2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制[D];长春中医药大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 田宝明;低血糖指数挂面的研制及其对糖尿病大鼠糖脂代谢影响的研究[D];西南大学;2015年

2 黄琼;姜黄素对糖尿病大鼠肺组织损伤的保护作用及其可能机制[D];湖北科技学院;2015年

3 褚淑蕾;PI3k-Akt信号通路在2型糖尿病大鼠易发心房颤动中的介导作用[D];福建医科大学;2015年

4 石鹰;二膦酸盐对糖尿病大鼠下颌骨骨折愈合影响的实验研究[D];河北联合大学;2014年

5 郑嫦;CNP对Ach引起的糖尿病大鼠胃平滑肌收缩增强的影响及IGF-1的干预效应[D];延边大学;2015年

6 李宁;益气养阴活血方对糖尿病大鼠大血管NF-κB表达的影响[D];河北医科大学;2015年

7 王婉秋;辛伐他汀对2型糖尿病动脉硬化大鼠血浆VEGF、TGF-β1及CTRP3水平的影响研究[D];石河子大学;2015年

8 宋倩;2型糖尿病患者血清TLR-4水平与骨密度及影响因素关系研究[D];河北医科大学;2015年

9 王丽霞;TLR4及相关炎症因子在糖尿病大鼠心脏、肝脏和肾脏中的表达[D];河北医科大学;2015年

10 孙雪培;极长链脂肪酸与2型糖尿病大鼠脑Aβ生成的关系研究[D];河北医科大学;2015年

，

本文编号：1620704