内源性一氧化氮合酶抑制物与1型糖尿病大鼠心功能及心肌线粒体功能障碍

发布时间：2016-11-03 10:10

  本文关键词：内源性一氧化氮合酶抑制物与1型糖尿病大鼠心功能及心肌线粒体功能障碍，由笔耕文化传播整理发布。

《中南大学》 2012年

内源性一氧化氮合酶抑制物与1型糖尿病大鼠心功能及心肌线粒体功能障碍

潘瑶  

【摘要】：一、研究背景和目的 糖尿病是严重危害人类健康的常见疾病,糖尿病并发心血管疾病,尤其是糖尿病心肌病已成为糖尿病病人死亡的重要原因。然而,其发病机制不清楚。糖尿病心肌病是一类不依赖动脉粥样硬化和高血压存在的特殊性、非缺血性心肌病。临床最早出现左心室舒张功能障碍,并左心室顺应性降低和左心室肥厚；然后发展为收缩功能障碍,左心室扩张并出现各种心律失常以致心力衰竭。糖尿病心肌病的主要病理改变是心肌微血管内皮细胞损害、内膜下纤维增生、毛细血管基底膜增厚、间质炎症、心肌纤维化、心肌细胞凋亡等。临床上糖尿病主要分为1型和2型糖尿病；虽然临床上90%的糖尿病都是2型糖尿病,但1型糖尿病大多发病早,在青少年期间就发病,故病程长；而且治疗上依赖胰岛素,因此更易并发心血管并发症。越来越多的文献报道,糖尿病心肌病与线粒体功能障碍密切相关；我室近年来也研究发现,在高脂饲养加小剂量的链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射诱导的2型糖尿病大鼠,血中内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非对称二甲基精氨酸(ADMA)明显升高,并与心肌线粒体功能障碍和线粒体生物合成降低有关；但未同步检测糖尿病大鼠心功能的变化。因此,本研究拟在STZ诱导的1型糖尿病大鼠,进一步探讨内源性ADMA升高与糖尿病心功能不全和心肌线粒体功能障碍三者之间的关系,为阐明糖尿病心肌病的发病机制提供新的实验数据。 二、方法 1、动物实验：给两月龄体重在200～220g的雄性SD大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(65mg/kg,溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.2)以制备1型糖尿病大鼠模型；采用颈动脉插管至左心室直接检测血流动力学和心功能指标的变化；测定心肌组织ATP含量,用RT-PCR检测心肌组织解偶联蛋白(UCP2)的转录水平；用PCR及RT-PCR测定心肌组织线粒体基因：细胞色素C氧化酶亚基I(COX I)与核基因：β-actin拷贝数的比值以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ线粒体生物合成；用高效液相色谱测定大鼠血清中ADMA浓度,用Western blotting检测心肌ADMA的主要合成酶：蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)和ADMA主要代谢酶：二甲基精氨酸-甲胺水解酶(DDAH),以及内皮型NOS (eNOS)和诱导性NOS (iNOS)蛋白表达,用比色法测定心肌组织DDAH及NOS活性以及NO代谢产物含量,以反映心肌组织PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路的变化；还测定心肌组织脂质过氧化产物：丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶：超氧化物岐化酶(SOD)活性以反应氧化应激。 2、细胞实验用内源性NOS抑制物ADMA和外源性NOS抑制物L-硝基精氨酸(L-NNA)或L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)孵育培养的大鼠心肌细胞株H9C2细胞48h,然后用Western blotting检测心肌细胞中PRMT1/DDAH/ADMA/NOS通路蛋白的表达改变。 三、结果 1、动物实验：与正常大鼠相比,STZ诱导的1型糖尿病大鼠血糖明显升高,尿糖呈强阳性,体重明显下降,心脏质量也下降,使心指数(HMI)相对增加；糖尿病模型大鼠心率(BPM)比正常大鼠明显减慢,心动周期延长,收缩期也延长；左心室等容舒张压平均变化速率(IRP Average dp/dt)明显降低,舒张期左心室内压下降最大变化速率(Min dp/dt)也显著减慢,反应糖尿病大鼠心脏舒张功能明显损害；此外,左心室收缩压(Max pressure)降低,舒张压(Min pressure)升高,左心室舒张末压(EDP)也升高,这些指标虽无统计学上的显著性,但是左心室发展压(Max-Min pressure)明显降低,提示心脏收缩功能也受到轻度损害。与正常对照组大鼠比较,糖尿病大鼠心肌组织反映线粒体DNA含量的COX Ⅰ/β-actin比值明显降低,线粒体生物合成的关键调节因子即PGC-1α的转录下调,表示糖尿病大鼠心肌线粒体生物合成减少；解偶联蛋白UCP2转录水平升高,但是心肌组织ATP含量却是增加的。与正常对照组大鼠比较,糖尿病大鼠血清中ADMA浓度明显升高,心肌组织DDAH活性有降低趋势,NOS活性明显无变化,iNOS活性增加,NO代谢产物增加；糖尿病大鼠心肌组织ADMA的主要产生酶PRMT1蛋白表达上调,而主要分布在心血管系统的ADMA主要代谢酶DDAH2的蛋白表达则降低,DDAH1表达无明显改变；iNOS表达上调,而eNOS表达降低,提示糖尿病时内源性ADMA升高是由于其生成酶PRMT1上调和其代谢酶DDAH2表达下调所致。经相关性分析,内源性ADMA浓度与左心室发展压(Max-min pressure)呈负相关,而与左室舒张压下降的最大速率(Min dp/dt)呈正相关；此外,内源性ADMA浓度还与线粒体DNA含量或线粒体生物合成呈负相关,而与UCP2转录水平呈正相关。 2、细胞实验结果：用内源性NOS抑制物ADMA和外源性NOS抑制物L-NNA或L-NAME孵育培养的大鼠心肌细胞株H9C2细胞48h,明显增加ADMA主要生成酶PRMT1表达,降低ADMA主要代谢酶DDAH1和DDAH2的表达,上调iNOS表达,而eNOS表达无明显变化；此结果与糖尿病大鼠心肌组织PRMT1/DDAH/NOS通路的蛋白表达一致。 四、结论 1、糖尿病大鼠内源性NOS抑制物ADMA含量明显增加,可能是由于其合成酶PRMT1的蛋白表达上调和其主要代谢酶DDAH2的蛋白表达下调所致； 2、糖尿病大鼠心脏舒张功能明显损害,收缩功能轻度受损； 3、糖尿病大鼠心肌线粒体生物合成明显抑制,可能是其主要调节因子PGC-1α转录下调所致； 4、糖尿病大鼠内源性ADMA升高与心脏舒张和收缩功能损害有关；亦与心肌线粒体生物合成呈负相关,与UCP2上调呈正相关。

【关键词】：
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R587.1
【目录】：

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